《发光免疫分析技术》ppt课件

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1、化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术慨述-化学发光-化学发光效率化学发光剂和标记技术-化学发光剂-发光剂的标记技术化学发光免疫分析的类型-直接化学发光免疫分析-化学发光酶免疫分析-电化学发光免疫分析什么是发光免疫分析？是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。放射免疫技术酶免疫技术发光免疫技术三大经典标记技术发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:光照发光、生物发

2、光、化学发光等。发光的基础知识光照发光（photoluminescence）指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，其回至基态时，发射出较长波长的光。生物发光（bioluminescence）是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。化学发光发光的基本类型化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时，

3、吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。化学发光又分为：直接化学发光间接化学发光什么是化学发光一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程简单地描述如下：A十BC*C*C＋h·γγ为光子，C*表示C处于激发态直接化学发光若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态

4、时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程表示如下：A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ间接化学发光化学发光剂和标记技术在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。一、化学发光剂发光的量子产率高；它的物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；其化学发光常是氧化反应的结果；在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性化学发光剂的基本条件直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记

5、抗原或抗体。（一）直接化学发光剂一.代表物质：吖啶酯，在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。二.另一类代表物质：三联吡啶钌，[RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。三联吡啶钌电化学发光剂反应原理利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂。代表物质：鲁米诺及其衍生物，AMPPD（二）酶促化学发光剂鲁米诺增强发光反应原理AMPPD〔3-(2‘-螺

6、旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕化学发光免疫分析的类型用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。一、直接化学发光免疫分析发光YYY磁微粒子被测抗原+抗体+丫啶酯标记物抗体YYYYYYYYYY

7、Y冲洗后（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入碱（pH>10）直接化学发光分析--夹心法电化学发光免疫分析（electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。二、电化学发光免疫分析磁性微粒为固相载体包被抗体(抗原)，用三联吡啶钌标记抗体(抗原)，在反应体系内待测标本与相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记

8、抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时引人TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化