化学发光免疫分析技术1

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1、第十章化学发光免疫分析技术第十章化学发光免疫分析技术第一节慨述一、化学发光二、化学发光效率第二节化学发光剂和标记技术一、化学发光剂二、发光剂的标记技术第三节化学发光免疫分析的类型一、直接化学发光免疫分析二、化学发光酶免疫分析三、电化学发光免疫分析四、临床应用思考题小结发光免疫分析:是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。第一节概述放射免疫技术酶免疫技术发光免疫技术三大经典标记技术发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:光照

2、发光、生物发光、化学发光等。光照发光（photoluminescence）是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。生物发光（bioluminescence）是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中

3、的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。一、化学发光一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下：A十BC*C*C＋h·γ其中γ为光子，C*表示C处于单线激发态。若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下：A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率（φCE）和激发态分子的发射效

4、率（φEM）。化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。二、化学发光效率第二节化学发光剂和标记技术在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。一、化学发光剂能作为化学发光剂的条件：①发光的量子产率高；②它的物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；③能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；④其化学发光常是氧化反应的结果；⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。㈠直接化学发光剂直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应

5、，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。1.吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。2．三联吡啶钌三联吡啶钌[RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。三联吡啶钌电化学发光剂反应原理㈡酶促反应发光剂：是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。1．鲁米诺及其衍生物2．AMPPD1．鲁米诺鲁米诺发光原理鲁米诺增强发光反应原理2．AMPPD〔3-(2‘-螺旋金刚烷

6、)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕1.碳二亚胺（EDC）缩合法二、发光剂的标记技术2.过碘酸钠氧化法3．重氮盐偶联法4.N-羟基琥珀酰亚胺活化法1．发光剂的选择2．被标记蛋白质的性质3．标记方法的选择4．原料比5．标记率6．温度7．纯化与保存影响标记的因素第三节化学发光免疫分析的类型用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分

7、光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。一、直接化学发光免疫分析发光YYY磁微粒被测抗原+抗体+带丫啶酯标记物抗体YYYYYYYYYYY冲洗后---夹心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入碱（pH>10）直接化学发光的机理磁微粒模式图YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特点抗原和抗体结合与未结合部分的易分离磁微粒技术化学发光酶免疫分析（che