化学发光免疫技术

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1、化学发光免疫技术第一节发光与化学发光剂第二节发光酶免疫测定（CLEIA）（chemiluminescenceenzymeimmunoasssay）第三节化学发光免疫测定技术(CLIA)（chemiluminescenceimmunoassay）第四章电化学发光免疫测定技术(ECLI)(electrochemiluminescenceimmunoassay)化学发光免疫技术：集灵敏的化学发光分析和特异的抗原抗体免疫测定于一体的检测技术。概念特点：特异性高、敏感性高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。化学发光免疫技术的类型按发光剂不同分为1.发光酶免疫测定（CLEIA）chemilum

2、inescenceenzymeimmunoasssay2.化学发光免疫测定技术(CLIA)chemiluminescenceimmunoassay3.电化学发光免疫测定技术(ECLI)electrochemiluminescenceimmunoassay按分离方法不同分1.微粒子化学发光免疫测定2.磁颗粒化学发光免疫测定第一节发光与化学发光剂一、发光一种物质由电子激发态回复到基态时，释放出的能量表现为光的发射。1.光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。2.生物发光:反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回复到基态时

3、多余的能量以光子形式放出。3.化学发光:在常温下由化学反应产生的光的发射。化学发光是一个多步骤的过程。荧光素酶ATP；O2；Mg2+氧化萤火虫荧光素萤火虫荧光素生物发光返回光+AMP+O2+CO2+化学发光机制：某些化合物可以利用化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。二、化学发光剂化学发光剂或发光底物：在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物。发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂①能参与化学发光反应；②与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂；③偶联后仍保留高的量子效

4、应和反应动力；④应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫活性。化学发光剂应符合以下几个条件返回1.酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。CLEIA中常用的酶有HRP和APHRP的发光底物有鲁米诺、对-羟基苯乙酸AP的发光底物有AMPPD、4-MUP（荧光底物）特点：可作标记物、也可作过氧化物酶的底物1.1鲁米诺H2O2/OH—HRP+N2+H2O+光对-羟基苯乙酸（HPA）HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长的荧光，可用荧光光度计测量。1.2HPAH2O2HRP+荧光氧化二聚体AMPPDAMPPD

5、在碱性条件下，被AP酶解生成相当稳定的AMP-D阴离子，其有2～30min的分解半衰期，发出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度达到高峰，15～60min内光强度保持相对稳定。光AP/OH—HPO42—1.3AMPPD4-MUP发出448nm的荧光4-MUP被AP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm的激发光的作用下，，可用荧光光度计进行测量。荧光AP1.44-MUP4-MU360nm激发光H3PO4+2.直接化学发光剂特点：不需催化剂，只需改变溶液的pH等条件就能发光的物质。反应迅速、背景低、信比高，发光量与AE浓度呈线性关系。常用试剂：吖啶酯（acridinium，AE）+CO2

6、+光3.电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。特点：①反应在电极进行；②电子供体为：三丙胺（TPA）③化学发光剂：三联毗啶钌返回三联毗啶钌分子结构图第二节发光酶免疫测定（CLEIA）一、原理属于酶免疫测定的一种。只是最后一步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应发出的光在特定的仪器上进行测定。二、技术类型根据酶促反应底物不同可分为：1.荧光酶免疫测定技术2.化学发光酶免疫测定技术根据免疫学反应模式分1.双抗体夹心法和双抗原夹心法3.固相抗原竞争法：荧光酶免疫测定技术反应原理图洗涤弃上清是利用理想的酶荧光底物，生成的产物稳定并有强的荧光强度，通过测定荧光强度进行定量。化学发光

7、酶免疫测定技术反应原理图洗涤弃上清是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，通过光强度的测定而直接进行定量。电化学发光原理图这一过程可在电极表面周而复始地进行产生许多光子，使光信号增强返回激发态不稳定基态电极1.抗原抗体结合反应将已包被了抗体的乳胶微粒和待测标本加入反应杯中，经温育一定时间后,再加入AP标记抗体，温育,形成固相包被抗体-抗原-酶标抗体复合物技术要点2.分离技术将复合物转移到玻璃纤维上，