5.1dna粗提取和鉴定

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1、课题1DNA的提取与鉴定一、DNA的粗提取与鉴定的原理1、DNA粗提取的方法和原理（1）提取思路利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。（2）DNA与蛋白质的性质差异①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图当NaCl浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随着NaCl的浓度增加而降低；当高于0.14mol/L时，DNA的溶解度随着NaCl的浓度增加而增加。蛋白质溶解度NaCl浓度蛋白质溶解度随着NaCl的浓度增加先增加后降低，在浓

2、度较高时溶解度较低，蛋白质会析出。蛋白质的溶解度与NaCl浓度之间的关系例如：当NaCl浓度为mol/L时，DNA溶解，而蛋白质部分发生盐析沉淀；而当浓度为0.14mol/L时，DNA析出，而蛋白质溶解。故选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。②DNA不溶于酒精溶液，蛋白质则溶于酒精，DNA析出，除去溶于酒精的蛋白质。③DNA与蛋白质对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。如：蛋白酶能水解蛋白质，对DNA没有影响；大多数蛋白质不能忍受60—80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性；洗涤剂能瓦解细胞膜，但对

3、DNA没有影响。2、鉴定原理在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。DNA+二苯胺蓝色沸水浴二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计1、实验材料的选取从理论上讲，凡是含DNA的组织都可以作为提取DNA的原材料，但选用含量较高的材料，实验的成功率高。目前通常用鸡血作为实验材料。注意：（1）哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和细胞器，不含DNA，不适合作实验材料。（2）选择鸡血的原因①DNA含量丰富，价格便宜，材料易得。②鸡血细胞极易吸水涨破（3）若选用其它动物或植物细胞，则必须充分研磨。2、实验步骤（1）.制鸡

4、血细胞液0.1g/mL柠檬酸钠100mL活鸡鲜血180mL500mL烧杯中，玻棒搅拌，离心或静置沉淀。血浆血细胞9注意：加柠檬酸钠的目的：抗凝。①用玻璃棒缓慢搅拌，使混匀血液与柠檬酸钠溶液，防止血液凝固。②静置、离心的目的使血细胞与血浆分离。（2）破碎细胞，获取含DNA的滤液操作：向鸡血中加入20mL的蒸馏水。目的：促进细胞吸水破裂，释放出核物质。操作要求及目的：①搅拌（单向、快速、5min），加速血细胞的破裂②过滤（1—2层纱布），除去颗粒较大的杂质（如：细胞膜、核膜等残片），获取含DNA的滤液（3）溶解细胞核内的DNA方案一：操作：向滤

5、液中加入2mol/L的NaCl溶液40mL。目的：溶解DNA（去除杂质）操作要求及目的：搅拌：单向、缓慢、1min；促进DNA的溶解方案二：滤液中加入嫩肉粉方案三：滤液放在温度为60—75℃保温10—15min。（4）析出含DNA的黏稠物操作：加蒸馏水至黏稠物不再增加为止。目的：降低NaCl溶液的浓度，析出DNA操作要求及目的：搅拌：单向、轻缓；混匀溶液，促进析出完整的DNA分子。（5）获取含DNA的黏稠物操作：过滤（3—4层纱布）目的：获取含DNA的黏稠物，滤液不要。（去除溶于0.14mol/LNaCl溶液的杂质。）（6）将DNA的黏稠物

6、再溶解操作：加入2mol/L的NaCl溶液20ml。目的：再次溶解DNA操作要求及目的：搅拌：单向；使黏稠物尽可能多的溶解在溶液中。（7）过滤含有DNA的NaCl溶液操作：过滤（3—4层纱布）目的：过滤掉杂质，收集含有DNA的滤液（去除不溶于2mol/LNaCl溶液的杂质。）到此为止一共经历了几次过滤？？能不能总结过滤前加入了什么？纱布上留下什么？（8）提取杂质较少的DNA操作：加入冷却的与滤液体积相等的、体积分数为95%的酒精溶液，静置2—3min目的：让部分杂质溶于酒精，析出含杂质较少的DNA。操作要求及目的：①搅拌：单向；促进杂质溶解

7、、DNA的析出②用玻璃棒卷起丝状物，用滤纸吸水；获得DNA（白色丝状物）（9）DNA的鉴定操作：①向2支试管中各加入2mol/L的NaCl溶液5mL，将丝状物（自变量）放入其中一直试管中。②各加入4mL二苯胺试剂。目的：设置对照操作要求及目的：①搅拌：促进DNA的溶解②沸水浴5min，冷却后观察颜色，丝状物所在试管中溶液变蓝色。提取细胞核物质：溶解核内DNA：在滤液中加2mol/L的NaCl溶液并搅拌，使染色质中DNA与蛋白质分离，DNA充分溶解，过滤(除杂质)析出DNA：DNA黏稠物再溶解：在烧杯中用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。

8、提取较纯净的DNA：DNA的鉴定：取两试管各加2mol/L的NaCl溶液，将DNA充分溶解于其中一试管，然后向两试管加入二苯胺试剂，混匀沸水中加热5min后冷却，可发现DNA与试