张赛-免疫层析技术研究进展

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1、免疫层析技术研究进展引言免疫层析测定法（ImmunoehromtogaphicAssay，简称ICA）是出现于20世纪80年代初期，将免疫标记技术与层析技术结合的一种新型检测技术。它是利用标记物的显色特性及层析法的分离技术定性、半定量或定量地检测待测物。以胶体金标记为代表的免疫层析方法已广泛应用于各种标志物检测中，但由于胶体金免疫层析只能用于定性或半定量的检测，难以满足临床检测指标定量化的要求；同时检测结果靠肉眼判断，特别是在检测结果呈弱阳性时，极易造成人为漏检现象，因此存在灵敏度较低等问题。而一些新型免疫层析技术不存在胶体金需大量聚集才能显色的缺点

2、，其以特有的光电磁信号放大系统提高检测灵敏度，减少样品的本底干扰，拥有传统标记物所无法比拟的优势。免疫层析技术正朝着定量、高灵敏度、多标记检测等方向发展。本文对现有免疫层析技术的原理、特点及其应用进行阐述并探讨快速免疫检测技术的发展趋势。1胶体金免疫层析技术1.1胶体金免疫快速诊断技术的原理胶体金免疫层析法（GICA）是在单克隆抗体技术、胶体金标记技术以及免疫层析技术的基础上发展起来的快速体外诊断技术，是继放射免疫分析、酶免疫分析和荧光免疫分析三大技术之后，应用最为广泛的免疫分析技术。该技术主要是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在硝酸纤维素膜（NC膜

3、）上，胶体金标记试剂吸附在结合垫上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待测物和金标试剂的复合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。而流离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离的目的。目前主要有四种方法用于快速诊断技术上：1）双抗夹心法：用于检测病原微生物性的大分子抗原的检测[1,2]；2）竞争法：用于检测小分子抗原[3-5]；3）双抗原夹心法：用于检测特异性的抗体[6]；4）反向流动层析法：此

4、法可以同时检测同种病原微生物的抗体IgG和IgM[7]。此外还有双面试纸条法（可同时检测IgG和IgM），间接法（用于检测体液中的抗体成分）和捕获法（常用于检测IgM，可用于传染病的早期诊断），后两种方法在免疫层析试验中应用较少。1.2胶体金免疫层析技术优点胶体金技术利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理，采用银显影剂增强金颗粒的可见性，大大提高测定灵敏度，实验结果表明可达到ELISA的灵敏度水平。胶体金大多用于单克隆抗体标记，对组织细胞的非特异性吸附作用小，故具有较高的特异性。检测一般只要5～10min就会出结果，相比其它方法（如ELISA需1

5、～2h，PCR需要时间更长）大大的缩短了检测时间。检测结果直接用颜色显示，肉眼判断容易，不需要特别仪器设备，只需要试纸条或渗滤试剂盒，样品只要做非常简单的处理或不需要做前处理（可以是组织液、血清、粪便和尿液等）。而且成本较低，操作简单，试剂非常稳定，不受温度等外界因素影响，因而可在医院、家里、办公场所甚至野外进行各种疾病的检测，检测结果也可长期保存。1.3胶体金快速诊断技术的研究和应用胶体金免疫层析技术因其方便灵敏、简单快速及稳定性强等优点已广泛用于诊断领域中，如病原体抗原抗体[8,9]、人体疾病相关蛋白[10]、药物滥用[11]以及寄生虫相关抗原抗

6、体的检测[12]等。胶体金免疫层析虽有很多优点，但在实际应用中也存在一些不足，例如，胶体金与抗原/抗体之间通常是采用物理吸附的方法结合的，这就造成了胶体金标记物的不稳定，抗原/抗体容易从金纳米颗粒表面脱落下来；胶体金免疫层析只能给出定性或半定量的结果，由于仪器的限制，目前还能准确的定量，这些不足也是胶体金免疫层析技术未来发展的主要方向。2新型免疫层析技术概况目前，已经应用于免疫层析标志物的新型纳米材料包括、荧光胶乳、量子点（quantumdots,QDs）上转磷光纳米粒子（up-convertingphosphor,UCP）、纳米磁珠等几大类。这些新

7、兴的标记方法有效规避了吸收光谱型标记物（胶体金、胶体硒、乳胶微球）须大量聚集才能显色的缺点，也有效减少了样本的本底干扰，在层析检测中显示了更大的潜力。2.1荧光胶乳标记免疫层析荧光胶乳是指将荧光染料通过物理吸附法、自组装法、化学键合法、共聚法、包埋法等[13]方法吸附或包埋到粒子内而形成的直径在纳米至微米级（0.01~10μm）范围内，受激发光源激发能发出荧光的固体微粒。在微球壳结构的作用下，它具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性。形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界

8、环境介质变化的影响[14]。该乳胶层析法具有特异性强、灵敏度高的特点，比一般的胶体金等固相免疫灵敏10～10