微生物源抗生素类次生代谢物抗细菌活性测定 抑菌圈法征求意见稿.docx

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1、GB/TXXXXX—201X中华人民共和国国家标准ICS07.080A21微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定抑菌圈法Themethodofassayingantibacterialactivityformicrobialsecondarymetabolites——inhibitionzonemethod（征求意见稿）发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会201X-XX-XX发布201X-XX-XX实施1GB/T××××—201×前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位：本标准主要起草人：5GB

2、/T××××—201×微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定抑菌圈法1范围本标准规定了微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性抑菌圈法测定原理、仪器设备及器具、试剂和材料、操作步骤和结果判定。本标准适用于微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定.2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1抑制中浓度medianinhibitionconcentration，IC50次生代

3、谢产物对细菌的抑制率达到50%时所用的浓度。3.2抑细菌活性antibacterialactivity具有抑制细菌生长繁殖的能力。3.3抗菌圈zoneofmicrobialinhibition也称抗菌圈，固体培养基表面与试样接触的边界处无菌繁殖的环带区域。4原理利用待测次生代谢产物在琼脂平板中扩散使其周围的细菌生长受到抑制形成的抑菌圈大小，计算IC50来判定待测次生代谢产物抑菌效果。本方法适用于微生物源抗生素类次生代谢产物的抗细菌活性测定方法。5GB/T××××—201×5仪器设备及器具5.1超净工作台可满足无菌要求的洁净工作台、生物安全柜或无菌室。5.2恒温培养箱温度范围5℃~50℃。5.

4、3电子天平精度为0.0001g。5.4无菌培养皿带陶瓦盖，直径90mm。5.5牛津杯不锈钢，标准规格：内径6mm、外径8mm、高10mm。5.6测量仪游标卡尺或抑菌圈测量仪，精度0.1mm。5.7分光光度计检测波长600nm。6试剂和材料本方法所用试剂均为分析纯，除特殊说明外，实验用水均为GB/T6682规定的二级水。6.1LB液体培养基胰蛋白胨10.0g酵母提取物5.0g氯化钠10.0g蒸馏水1000mL将上述各成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.0±0.2，分装至锥形瓶中，121℃灭菌20min，备用。也可采用市售的商业培养基。用途：用于指示菌菌种的活化及菌悬液的培养。6.2LB固

5、体培养基胰蛋白胨10.0g酵母提取物5.0g氯化钠10.0g琼脂20.0g5GB/T××××—201×蒸馏水1000mL将上述各成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.0±0.2，分装至锥形瓶中，121℃灭菌20min，备用。也可采用市售的商业培养基。用途：用于指示菌的培养及含菌检测平板的制备。6.3指示菌标准菌株革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）ATCC6538。革兰氏阴性菌：大肠杆菌（Escherichiacoli）ATCC11229。7操作步骤7.1冻干菌活化将冻干菌融化分散在5mL的LB液体培养基中成悬浮状，在37℃±2℃下培养18~24h。用

6、接种环取菌悬液以划线法接种到LB固体平板上，在37℃±2℃下培养18~24h。从培养皿上挑取典型菌落接种在LB固体培养基斜面试管内，，在37℃±2℃下培养18~24h。将试管斜面贮存于冰箱内（5℃~10℃），作为保存菌，保存期不超过一个月，每月传代一次，传代次数不超过10代。7.2试验菌悬液制备7.2.1用接种环取保存菌，以划线法接种到LB固体平板上，37℃±2℃下培养24h。注：平皿在5℃~10℃条件下保存，在1周内使用。7.2.2取LB液体培养基20mL放入100mL的三角烧瓶内，用接种环取7.2.1平皿上的典型菌落接种在LB液体培养基内培养。培养条件为：温度37℃±2℃，振动频率110

7、min-1，时间18~24h。7.2.3用蒸馏水20倍稀释LB液体培养基，用其调节培养后的菌浓度为1×108CFU/mL~5×108CFU/mL，作为试验菌液。采用分光光度计或适当的方法测定菌液浓度。注：试验菌液冰冷保存（3℃~4℃），在4h内使用。7.3供试样品制备将供试样品配置成一定浓度的母液，并用无菌水将母液按2倍浓度稀释，制备成至少5个不同浓度的待测溶液，备用。7.4检测平板制备倾注融化并冷却至55℃