微生物源抗生素类次生代谢产物杀线虫活性测定 浸虫法征求意见稿草案.docx

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1、GB/TXXXXX—201X中华人民共和国国家标准ICSXXXXA21微生物源抗生素类次生代谢产物杀线虫活性测定浸虫法Determinationofnematicidalactivityformicrobialsecondarymetabolites——Immersionmethod（征求意见稿）发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会201X-XX-XX发布201X-XX-XX实施1GB/T××××—201×前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位：本标准主要起草人：GB/T××××—201×4GB

2、/T××××—201×次生代谢产物杀线虫活性测定1范围本标准规定了微生物源抗生素类次生代谢产物杀线虫活性测定的原理、仪器设备、试剂与材料、操作步骤、结果分析。本标准适用于微生物源抗生素类次生代谢产物杀线虫活性的测定。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1致死中浓度lethalconcentration50%，LC50LC50指的是使受试线虫半数死亡的次生代谢产物的浓度。3原理将线虫浸入微生物源抗生素类次生代谢产物药剂中使线虫死亡，用中性红将线虫死细胞或组织染成在显微镜下可见的红色，通过染色情况判断次生代谢产物对线虫的致死情况，计算线虫的校正死亡率，根据校正死亡率的几率值和药剂浓度对

3、数的线性回归关系得到回归曲线，计算得到LC50，从而测定次生代谢产物杀线虫的活性。4仪器设备4.1恒温培养箱：温度偏差在±1℃以内。4.2显微镜：最小放大倍数为10倍。4.3电子天平：称量精度0.1g以上。4.4微量移液器。4.5离心机。4.6计数器。5试剂与材料所有试剂除另有说明外，均为分析纯，水为符合GB/T6682中规定的一级水。5.15mg/mL胆固醇溶液称取适量胆固醇，溶于相应体积的无水乙醇中，配成5mg/mL的胆固醇溶液，0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。5.21mol/L氯化钙溶液称取适量胆固醇，溶于相应体积的去离子水中，配成1mol/L的氯化钙溶液，0.22μm孔径的滤膜过滤

4、除菌。5.31mol/L硫酸镁溶液称取适量七水硫酸镁，溶于相应体积的去离子水中，配成1mol/L的氯化钙溶液，0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。4GB/T××××—201×5.41mol/L磷酸缓冲液，pH6.0称取118.1g磷酸二氢钾，23.0g磷酸氢二钾，溶解于900mL的去离子水中，调节pH值至6.0，再加去离子水定容到1L，0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。5.5线虫专用缓冲液（M9缓冲液）取3.0g磷酸二氢钾，6.0g磷酸氢二钠，5.0g氯化钠，1mL浓度为1mol/L的七水硫酸镁，用去离子水溶解，并定容到1L，0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。5.6次氯酸钠裂解液取0.1g氢氧化钠

5、，溶于3.5mL去离子水中，再加入1mL含活氯10-15%的次氯酸钠溶液混合。5.7琼脂培养基（LB培养基）称取10.0g胰蛋白胨，5.0g酵母粉，10.0g氯化钠，去离子水定容到1L，121℃灭菌20min。5.8线虫生长固体培养基（nematodegrowthmedia，NGM）称取2.5g胰蛋白胨，3.0g氯化钠，17.0g琼脂粉，用去离子水溶解并定容到975mL，121℃灭菌20min，冷却到55℃左右时，加入1mL浓度为5mg/mL的胆固醇溶液，1mL浓度为1mol/L的氯化钙溶液，1mL浓度为1mol/L的硫酸镁溶液，25mL浓度为1mol/LpH6.0的磷酸钾缓冲液。5.90

6、.1%（w/v）中性红溶液称取适量中性红粉末溶于相应体积的生理盐水中，配成0.1%的中性红溶液，0.22μm孔径的滤膜过滤。5.10N2野生型秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans，theBristolstrainN2）5.11尿嘧啶缺陷型大肠杆菌（EscherichiacoliOP50）6操作步骤6.1大肠杆菌OP50的培养与接种挑取大肠杆菌OP50单菌落于LB培养基中，37℃振荡过夜培养，取0.1mL菌液涂布于NGM固体培养基上，室温放置约30min。6.2N2野生型秀丽隐杆线虫的培养与同步化将N2野生型秀丽隐杆线虫接入含有大肠杆菌OP50的NGM固体培养基上，于20

7、℃培养3天，用M9缓冲液冲洗NMG固体培养基上，收集处于产卵期的线虫。用移液器吸取1mL含产卵期线虫的M9缓冲液至10mL的离心管中，向管中加入4.5mL次氯酸钠裂解液，上下颠倒混合约3-5分钟，约800g的转速离心2分钟，弃上清收集虫卵，用M9缓冲液重复洗涤和离心3次后，用0.2mL无菌M9缓冲液悬浮虫卵，将卵液转移到含大肠杆菌OP50的NMG固体培养基上，于20℃培养48h，线虫成长至四龄幼虫。6.3药剂活性测定6.