毕业论文--链霉素702所产抗菌物质的分离提取

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1、链霉菌702所产抗菌物质的分离提取吴小丽（江西农业大学生物工程系生物工程专业01级1班）指导老师：涂国全教授摘要：采用乙酸乙酯为洗脱剂经过硅胶柱层析方法，从链霉菌702发醇液中分离得到抑细菌物质的黄色晶体，纯度达到77.11%，用高效液相色谱（HPLC）的方法，使用乙腈的水溶液（乙腈/水=60/40）为流动相，检测波长为200nm，对此黄色晶体进行纯化,最终该物质的纯度达到了99.74%。关键词：链霉菌702分离纯化硅胶柱层析高效液相色谱0引言江西农业大学微生物研究室在开展微生物防腐剂产生菌的分离筛选研究中，从土壤中筛选到一株链霉

2、菌，编号为702。初步研究发现，该菌的发酵液进行抗菌活性的测定时，对各种细菌、霉菌和酵母菌等都具有很强的抑制作用[1]；而且生物活性物质耐热性能特别强，即使发酵液用100℃处理10小时、121℃处理1小时的情况下，其抑菌活性不会减弱[2]；发酵液对小白鼠进行急性经口毒性试验，均属无毒。鉴于链霉菌702发酵液的以上优点，本实验室根据抗生素分离提取的基本思路致力于试验出最佳分离提取方案和条件,最终从发酵液中分离纯化各活性单组分，并对活性单组分进行理化性质的研究和结构的鉴定，为进一步研究和开发该菌在工业领域应用提供科学的理论依据。1.材

3、料与方法1.1材料1.1.1供试菌株链霉菌702（Streptomyces702）发酵产物：由江西农业大学生物工程系应用微生物实验室提供。1.1.2抑菌测定指示菌啤酒酵母（SaccharomycesCerevisiae）；枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）；金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）；藤黄微球菌（Micrococcusluteus）。12由江西农业大学生物工程系应用微生物实验室保存提供。1.1.3抗菌活性测定培养基细菌培养基：（牛肉膏蛋白胨培养基）牛肉膏0.3%蛋白胨1%NaCL0.5

4、%琼脂2%PH调至7.2-7.4真菌培养基：PDA培养基1.1.4仪器设备及试剂1.1.4.1主要仪器(1)无菌操作工作台(2)生化培养箱LRH-250A型(3)旋转蒸发器(4)高压灭菌锅(5)离心机(6)干燥箱(7)1.5´50cm、3´120cm玻璃层析柱(8)BeckmanCoulterULTransphereODS（4.6mm*25cm）分析柱(9)AKTAExplorer100高效液相色谱仪（制备型）(10)BackmanSystemGold高效液相色谱仪（分析型）(11)MuMingPackingMaterial（25

5、mm*30cm）制备柱1.1.4.2器皿GF-254层析板；毛细吸管；三角瓶；培养皿；试管；试剂瓶；容量瓶；量筒；漏斗；移液管等。1.1.4.3主要试剂柱层析用硅胶（160-200目，200-300目）青岛海洋化工厂无水乙醇、乙酸乙酯（以上药品均为分析纯）、乙腈、甲醇（色谱纯）等。1.2方法1.2.1发酵液预处理链霉菌702下罐后发酵液4000r/min离心10min后，弃去上清液，菌丝体用无水乙醇浸提24h后过滤，取其滤液。1.2.2硅胶柱层析分离提取121.2.2.1上柱样品的制备取预处理后的发酵液滤液，用旋转蒸发器在45℃浓

6、缩，可得红色油状物；用乙酸乙酯溶解后过滤，可得红色溶液，为上柱样品[3]。1.2.2.2硅胶柱层析分离(1）称取500g160-200目柱层析硅胶，在烘箱中100℃烘1hrs，冷却后用乙酸乙酯浸泡并不时的搅动，使其中所含气泡逸出。(2）层析柱为3cm´120cm玻璃层析柱，事先用蒸馏水洗净，乙酸乙酯淋洗，保证无水后，以湿法装柱，注意避免气泡的产生和断层出现。(3）先于层析柱中装入1/3倍柱体积的乙酸乙酯，将混匀的硅胶及乙酸乙酯一边搅动，一边倒入柱中，同时从底部放出乙酸乙酯，但保证乙酸乙酯液面始终在硅胶上面，加入硅胶量为柱体积的6/

7、7左右。待硅胶沉降结实后，将处理好的样品用胶头滴管小心的沿管壁加入，待其要完全沉入硅胶中时，小心缓慢加入乙酸乙酯冲洗管壁及胶表面，冲洗干净后再小心将乙酸乙酯加至硅胶上方1-2cm高。(4)使流速控制在1.5ml/min，于下端用试管收集洗脱液。1.2.2.3洗脱液检测1.2.2.3.1生物活性检测将洗脱液用试管收集，每隔5管取收集液，用滤纸片法测其在腊质芽孢杆菌上的抑菌效果。滤纸片法操作如下:用打孔器在定量滤纸上打孔.得到直径5.5mm的圆形滤纸片，装于培养皿中121℃灭菌30min备用。将灭过菌的不锈钢镊子尖端在酒精灯火焰上烧红

8、，冷却后夹起一片滤纸片在待测液中浸湿，然后将滤纸片静置晾干。每种待测液重复3次，检测下一瓶待测液之前必须将镊子尖端在酒精灯火焰上烧红以破坏残留的待测物质，冷却后才能再次使用。最后将干燥的滤纸片均匀平铺于己倒好的双层含菌琼脂培养皿中，移动不同待测液的