破译密码的实验研究的发展

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1、破译密码的实验研究的发展破译密码的实验研究先后由三个实验逐步发展了四种破译方法，于1965年完成。体外实验折叠1）在体外无细胞蛋白质合成体系中加入人工合成的polyU开创了破译遗传密码的先河。自1961年发现mRNA后，许多实验室开始在无细胞蛋白质合成系统中加入mRNA,去研究蛋白质生物合成过程，并表明加入idRNA能刺激无细胞系统中蛋白质合成。1961年，美国NIH的Nirenberg和Mathaoi,设想:即然mRNA有刺激无细胞系统中的蛋白质合成作用,加入人工合成的多聚核昔酸亦将会有这种促进作用。按此设想，他们合成了polyU作为模

2、板，以观察无细胞系统中蛋白质合成速率。因为在反应体系中加入高驱2+浓度，可有利于IF（起始因子）的作用和fMet-tRNANet的形成，从而保证肽链合成的起始不mRNA的适当信号。当把翻译产物分离、纯化和做序列分析后，结果出乎意料，合成的肽链中的氨基酸残基全部是苯丙氨酸，即polyPheo于是第一次确认了UUU是Phc的密码子。这样，就在一个偶然的机会开创了破译密码的工作。随后，他们又以polyA和polyC为模板，证明了分别可指导合成polyLys和polyPro,即确定了AM是Lys的密码子，CCC是pro的密码子。但是类似的实验不能

3、证明GGG是何种氨基酸的密码子，因为polyG产生牢固的氢键结合，形成三股螺旋,而不与核糠体结合。混合共聚物碱基配对折叠2）混合共聚物（mixedcopolymers）实验对密码子中碱基组成的测定：1963年，Speyer和Ochoa等发展了用两个碱基的共聚物破译密码的方法。例如，以A和C原料，合成polyACopolyAC含有8种不同的密码子:CCC、CCA、CAA、AAA、AAC、ACC、ACA和CAC。各种密码子占的比例随着A和C的不同而不同，例如当A和C的比例等于5：1吋，AAA：AAC的比例=5X5X5：5X5X1=125：25

4、。依次类推。实验显示AC共聚物作模板翻译出的肽链由六种氨基酸组成，它们是Asp,His,Thr,Pro,和Lys,其屮Pro和Lys的密码子早先已证明分别是CCC和AM。根据共聚物成份不同的比例和翻译产物中氨基酸比例亦不同的关系，Speyer等确定了Asp、Glu和Thr的密码子含2AlC;IIis的密码子含lA2C;Thr的密码子也可以含lA2C;Pro为3C或lA2C;Lys为3A。但上述方法不能确定A和C的排列方式，而只能显示密码子中碱基组成及组成比例。例如，Asp,Glu和Thr的2A1C可能有三种排列方式,即AAC、ACA、CA

5、Ao此外，通过反复改变共聚物成份比例的方法亦十分麻烦和费时。aa-tRXA与确定的三核昔酸序列结合折叠正当Speyer等人按上述2）方法奋力时，Nirenberg和Leder于1964年建立了破译密码的新方法，即tRNA与确定密码子结合实验。该方法利用了如下事实：即是在缺乏蛋白质合成所需的因子的条件下，特界氨基酸-tRA（aa-tRNA）也能与核糖体-mRNA复合物结合。最重要的是这种结合并不一定需要反的mRNA分子，而三核昔酸实际上就可以与核糖体结合。例如，当polyU与核糖体混合时，仅有Phe-tRNA（苯丙氨酰-tRNA）与之结合

6、;相应地Pro-tRNA（脯氨酰-tRNA）特异地与polyC结合。还有GUU可促进Val-tRNA（缠氨酰-tRNA）结合，UUG促进Leu-tRNA（亮氨酰-tRNA）结合等。虽然所有64个三核昔酸（密码子）都可按设想的序列合成，但并不是全部密码子均能以这种方法决定因为有一些三核昔酸序列与核糖体结合并不象UUU或GUU等那样有效，以致不能确定它们是否能为特异的氨基酸编码。用重复共聚物破译密码折證3）用重复共聚物（repeatingcopolymers）破译密码：几乎在上述Nirenberg和Leder工作的同时,Nishimura,J

7、ones,和Khorana等人应用有机化学和酶学技术，制备了已知的核昔酸重复序列。蛋白质在核糖体上的合成可以在这些有规律的共聚物的任一点开始，并把特异的氨基酸参入肽链。例如，重复序列CUCUCUCUCU是多肽Leu-Ser-Leu-Ser或者是多肽Ser-Leu-Ser的信使分子.使用共聚物构成三核背酸为单位的重复顺序，如（MG）n,它可合成三种类型的多肽：polyLys、polyArg和polyGlu,即AAG是Lys的密码子，AGA是Arg的密码子，GAA是Glu的密码子。又如（AUC）n序列是polyIle^polySer和poly

8、His的模板。如此至1965年破译了所有氨基酸的密码子。遗传学的第二套密码系统折叠遗传学的第二套密码系统（Thesecondgeneticcode）以上所述存在于mRNA中的遗传密码称为经典密