慢病毒_生物学_自然科学_专业资料

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1、慢病毒慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起來的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、川•细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的棊因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。慢病毒表达载体，即通常所说的穿梭载体，包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装

2、RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组,从而高水平的表达效应分子。病毒表达系统腺病毒表达系统慢病毒表达系统逆转录病毒病毒基因组双链DNA病毒RNA病毒RNA病毒是否整合病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因病毒基因组整合丁•宿主基因组，长时间、稳定农达外源基因病毒基因组整合丁•宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞感染分裂

3、和不分裂细胞感染分裂细胞，但在干细胞中表达效率低农达丰度高水平衣达高水平表达高水平表达表达时间快（1-2天）慢（2-4天）快（1-2天）滴度滴度高达1012pfu/ml最高可达109-10TU/ml最高可达109-10TU/ml克隆容量可插入高达8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低可插入不超过8kb的外源片段,滴度随插入片段长度增加而降低可插入不超过6kb的外源片段免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性动物模型不能得到转基因动物可产生转基因动物，效率达50以上可以，但很难启动子可以更换特异性启动子可以更换特异性启动子不需要启动子能否用于MIRCORNA可以可以不可以能否用于四环素诱不

4、可以TET-ON.TET-OFF不可以导实验目的对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。实验滿呈1.根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；2.对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重纟R质粒；3.使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293T细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒液；4.浓缩、纯化病毒液；5.用髙质量的病毒液感染细胞；6.通过定量PCR梢确测定病毒滴度（高梢确滴定方法）和Western分析实验结果;7.用成质量的病毒液感染猪主细胞；检测基因功能或

5、者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。⑴操作手册编辑1慢病毒使用操作2慢病毒安全使用规范3悬浮细胞感染方法概要4相关专业术语（详情可参考公司网站FAQ）5细胞培养器血的相关参数1•慢病毒使用操作手册1.1慢病毒的储存与稀释：1.1.1病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4°C保存；如需长期保存请放置于・80°C（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）。A.病毒可以存放】：・80°C6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴

6、定病毒滴度B.反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用屋进行分装。1.1.2的稀释：用户盂要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养冃的细胞用PBS或无血清培养革（含血清或含双抗不影响病毒感染）混匀分装后4°C保存（请尽量在三天内用完）分装后使用。1.2慢病簿用于体外（InVitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞1.2.1慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒Z前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的冃的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI值）以及

7、在体（InVivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。1.2.2慢病毒感染目的细胞预实验1.2.2.1慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A•测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时,需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞（HEK293T,Hela）作为平行实验的对照细胞。B.在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养