研究蛋白质折叠的单分子光谱学技术

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1、复旦大学论文集（2006）研究蛋白质折叠的单分子光谱学技术--提高FRET光谱学时间分辨率的理论方案03物理翟应腾（0319003）导师：现代物理研究所副研究员王志松摘要：蛋白质折叠一个多相过程，从展开态到折叠态发生一系列复杂的微观过程，传统测量技术对大量蛋白质分子的平均过滤掉了关键的动力学信息。而单分子荧光共振能量传递光谱学（简称sp-FRET）有能力测量单个分子，是近十年来发展起来的蛋白质折叠研究的新技术。但这种实验手段的时间分辨率远不够捕捉快速折叠过程[11]。为了提高sp-FRET技术的时间分辨率。我们从量子光学出发，

2、提出并定量研究了一系列增强单分子发光的方案。我们的计算表明，这些方法可能将时间分辨率提高3~4倍。关键词：蛋白质折叠(ProteinFolding)，FRET（fluorescenceresonanceenergytransfer），单分子光谱学(Single-MoleculeSpectroscopy)。一．背景介绍蛋白质折叠蛋白质是一种结构复杂但极其重要的一种生物大分子，蛋白质折叠过程的研究是生物物理的一个重要的前沿课题。为了研究这一过程可使用理论计算和实验测量两种手段。由于蛋白质折叠的过程涉及极多的自由度，并且其内部基团之

3、间有复杂的相互作用，目前理论计算的方法面临极大挑战。而通过实验揭示蛋白质折叠的机理对相应的实验技术要很高的要求。近十年来发展的单分子光谱学技术（Single-moleculeSpectroscopy）为研究蛋白质折叠提供了全新的手段。这个方法是利用基因定点突变的技术将单个荧光分子结合在蛋白质分子的选定部位，通过探测单分子的发光信号来得到折叠过程的信息。SMS的一个实际应用便是FRET。如果分子间的距离小于15nm，通过偶极子相互作用激发能量可以在荧光分子对之间传递，这个过程被称为共振能量传递。取决于环境与分子对本身的性质，这个

4、过程可以是可逆的或不可逆的[7]。这种方法不仅适用于测量静止距离而且可以反映距离的变化。现代技术可测量单受体和单供体间的能量传递，即单分子对FRET(singlepairFRET)[1]。与传统的大数测量相比，单分子测量具有极大优势。生物分子的运动及构象动力学的细节在大数目体系的测量中是观察不到的。因为必须让所有被观察的分子同步运动才能在整体观察下得到这些信息。由于分子运动的随机性，同步基本上是不可能的，因此这些关键的动力学信息就会被平均掉，使实验者难以分辨。特别是研究蛋白质折叠，由于折叠过程的随机性，即使采用激光温跳和微流体

5、快速混合技术也难使大量蛋白质分子同步开始折叠过程。而单分子测量不需要让所有的分子同步反应。特别是室温下的单分子探测和单分子荧光光谱学的最新进展提供了新的工具研究生理条件下的单个生物大分子。这一点的意义十分重大[1]。-95-复旦大学论文集（2006）spFRET简介图1取自文献[2]Credit:B.Schuler,E.A.Lipman&W.A.Eaton图1给出了一个具体的sp-FRET实验的例子。一个绿色的供体染料分子和一个红色的受体染料分子被连接在一种细菌的蛋白质(CspTm)上，当这个折叠着的蛋白被一束聚焦的激光照射时

6、。由于这两个染料分子只相距1nm，这导致被激发的供体染色分子的能量被迅速的传递给受体染料分子，并且大部分荧光光子由受体分子发出(a)。用化学变性剂使蛋白质展开，这导致两染料分子之间的平均距离变大(b)。结果导致能量传递效率降低，使受体发出的光子的比例降低。为了定量分析上述结果，将两个长度不同且不随变性剂浓度变化的有机分子（Pro）6和（Pro）20的两端标记上相同的荧光染料分子(c，d)。并认为这个系统其他参量的变化用蛋白质的那个实验相同[2]。时间分辨率问题由于单个荧光分子在单位时间发出的光子数极少，通过统计手段得到的数据涨

7、落很大。时间分辨率越低，所得的曲线越类似与泊松分布曲线，蜕化为大数目情况[11]。为了解决这一问题我们提出利用多个分子间的梯次共振能量传递再辅以微型光学共振腔的理论方案以增加荧光分子的发光强度，从而改进实验的时间分辨率，提高实验数据的精度。二．多个分子间的梯次共振能量传递-95-复旦大学论文集（2006）图3图2如图2，我们认为目前荧光受体分子退激发速率太低是导致时间分辨率不足的一个最重要的原因。为了提高受体分子释放能量的速率，我们让受体分子除了自身退激发发出光子之外，还有很大的几率将自身的能量传递给第三种荧光分子。由于这些分

8、子的先后发光延迟很短（ps量级），因此第三种分子的发光带有基本同样的动力学信息。我们称这一组荧光分子为分子泵。这样可以提高整个能量传递系统的发光强度，以提高测量的时间分辨率。由于器件（分子泵）的尺度小与驱动他们的光的波长。多分子相干激发是有可能的。然而，去相干效应在一个分子系