论文实例：分子伴侣、蛋白质聚集和大分子拥挤环境对蛋白质折叠的影响

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1、论文实例：分子伴侣、蛋白质聚集和大分子拥挤环境对蛋白质折叠的影响“分子伴侣”的发现和鉴定改变了蛋白质折叠研究的经典概念，开辟了崭新的蛋白质生物合成研究的时代，为解译第二遗传密码并最终全面阐明分子生物学中心法则奠定了基础。分子伴侣功能的研究是蛋白质折叠研究领域中最活跃的前沿，其中分子伴侣与其帮助的靶蛋白之间的识别、相互作用以及解离又是分子伴侣作用机制研究最根本的内容。李剑研究了当前最受注意的分子伴侣GroEL与同源四聚体的3－磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、单肽链的溶菌酶以及GroEL的辅助分子伴侣GroES的相互作用模式。通过分析（GroEL－靶

2、蛋白折叠中间体）复合物的成分，以及抑制变性靶蛋白复性过程中的聚集等细致的实验，他发现不同的靶蛋白与GroEL的结合有不同的模式。一个GroEL分子能够结合两个亚基的GAPDH折叠中间体而形成稳定的复合物，该复合物不能再结合其他的GAPDH折叠中间体，却能再结合一个溶菌酶折叠中间体或者一个GroES分子。该结果表明二体的GAPDH折叠中间体是结合在GroEL分子的一端，表现为“半位结合”。对溶菌酶，GroEL既能在一端结合一分子的溶菌酶折叠中间体又能在两端各结合一个中间体而形成1：1和1：2的“全位结合”复合物。由一分子GroEL和一分子GroES

3、形成的复合物还能够再结合一个溶菌酶中间体或一个二体的GAPDH中间体而形成一个稳定的三元复合物。此外，结合了一分子溶菌酶或是两个亚基的GAPDH的GroEL，分别为（GroEL-溶菌酶1）(GroEL-GAPDH2)，只能在另一端再结合一分子GroES而形成反式三元复合物。根据GroEL同GAPDH折叠中间体结合的化学计量比以及包含有（GroEL－GAPDH2）的三元复合物的形成规律，推断在GroEL帮助GAPDH复性过程中是仅在其分子一端结合一个二聚化的GAPDH中间体。该工作为四聚体GAPDH的折叠和组装的复性机制以及分子伴侣GroEL帮助其

4、复性的作用机制贡献了新的丰富的信息。聚集的蛋白加速但不增加3－磷酸甘油醛脱氢酶的聚集—蛋白聚集的特异性近年来认识到蛋白质构象病的共同机制是蛋白质发生聚集。最近一二年又认识到所有的蛋白质都可能在某些条件下发生聚集，而蛋白质的聚集对细胞往往是有害的，甚至引起疾病。因此蛋白质聚集的固有性质和其危害性成为蛋白质折叠研究的另一侧重热点。李剑通过蛋白聚集体对3－磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）去折叠和重折叠过程中聚集的影响研究蛋白质聚集的规律性。GAPDH在去折叠和重折叠过程中发生的聚集呈现S型曲线。蛋白聚集体的存在加速GAPDH的聚集，但不增加聚集的量也不影

5、响GAPDH最终的复性效率。说明蛋白聚集体作为种子通过疏水相互作用只诱导那些注定要聚集的GAPDH折叠中间体聚集，而不改变GAPDH原来的折叠途径中正确重折叠蛋白和错误折叠而发生聚集的分配比例。此外，两种不同的蛋白在同一系统中共同复性时不相互干扰。这些发现有助于我们了解细胞如何保证一种蛋白在折叠时不受其他蛋白聚集体影响的机制。只有还原脱钙的牛乳清白蛋白能够被蛋白聚集体诱导而发生聚集牛乳清白蛋白（LA）是一种钙结合蛋白，其不同状态的构象已为很好鉴定，因此是蛋白质折叠研究的好材料。还原脱钙的牛乳清白蛋白（r-LA）在25℃中性还原性的缓冲液中是可溶性

6、蛋白，以“前熔球态”存在。但是随着不同种类蛋白聚集体的加入，r-LA便发生聚集。但蛋白聚集体不能诱导天然的LA和只脱钙的处于“熔球态”的LA发生聚集。分子伴侣蛋白二硫键异构酶或者化学分子伴侣聚乙二醇抑制这种诱导聚集的发生。天然蛋白、不聚集的折叠中间体以及可溶性的聚集体都不会诱导LA的聚集。经鉴定r-LA和蛋白聚集体之间的相互作用本质上是疏水相互作用。以前的工作表明分子伴侣识别r-LA，李剑的工作揭示了处于“前熔球态”的牛乳清白蛋白不仅是分子伴侣而且也是蛋白聚集体的识别对象，说明生物大分子之间相互作用的构象基础。大分子拥挤对6-磷酸葡萄糖脱氢酶和蛋

7、白质二硫键异构酶复性的影响蛋白质体外折叠的研究已经为人们认识细胞内新生肽链的折叠提供了大量的信息。为了避免伴随蛋白质去折叠和折叠过程中的聚集干扰研究，或为了通过基因工程得到可溶性蛋白，研究通常是在简单组成的缓冲液体系中进行，所用蛋白的浓度一般较低。可是细胞内的实际情况完全不是如此。所有的细胞中都存在着大量的蛋白质、核酸、多糖等各种生物大分子，总浓度高达50－400g/l，它们大约占用细胞容积的20－30，因此任何一种大分子都处于一个充满其他大分子的拥挤环境中。对源于排斥容积效应的拥挤理论分析表明它对所有大分子之间的反应在热力学和动力学上都有很大的

8、影响。可是以往人们在体外研究生物大分子的性质和相互作用时几乎都忽略了这样一个细胞大分子拥挤的实际环境。最近几年建议把大分子拥挤与pH、离