转几个基本实验的经验总结

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1、分子生物学实验常见问题分析及对策-141、Southern杂交技术成败主要取决于哪两个因素？答：Southern杂交技术的成败主要取决于两个因素：首先，用于探针的DNA纯度要高，否则影响特异性。其次是探针DNA的放射性比强度要高，因为增加放射性强，可提高检测水平。2、Southern杂交技术中的DNA的消化和电泳有哪些注意点？答：①选择的限制性内切酶应提供某种信息，通常消化前DNA中间长度至少应该三倍于消化产生的DNA中间长度；②高分子的DNA容易造成消化不均匀，所以要用大体系酶切；而若酶切体系太大，消化后不方便上样，

2、则可以对DNA进行浓缩，用乙醇沉淀DNA；③电泳电泳前，除乙醇，并且70℃水浴，这样也可以破坏限制性片段黏性末端之间的碱基配对；④消化后的DNA可以在4℃保存，但是电泳加样前需加热至56℃2~3分钟，破坏黏性末端碱基对；⑤酶切后，电泳上样前最好通过荧光测量法测DNA消化产物的浓度；⑥电泳前要保证DNA分散均匀，并且若是大分子量的DNA，要用大口径吸头吸取；⑦过夜电泳，低电压慢迁移率；⑧电泳后将凝胶用溴化乙锭染色，读胶，用透明荧光尺读取迁移距离；⑨电泳后的凝胶可以再4℃保存，但是不可超过一天。3、Southern杂交技术

3、中的膜转移有哪些注意点？答：①凝胶、膜、吸水纸大小要适中，差不多大，不能太大，防止造成短路。并且各层之间不能有气泡；②凝胶、膜都要做好标记，不能搞混；③转膜前要对凝胶中DNA片段进行变性、洗涤等工作，若目的DNA片段大于15kb，则变形前还要进行短暂脱嘌呤处理，使DNA产生缺口，提高转移效率；④不带电膜需用中性缓冲液，同时凝胶经变性后需用中性缓冲液洗涤；若是带点膜需用碱性缓冲液，则凝胶可直接进行转移，不需要变性。4、Southern杂交技术中杂交部分的主要因素有哪些，分别有什么关系？答：杂交步骤中主要因素有膜上的DNA

4、量、探针量以及结合效率等；杂交的灵敏度可达到0.1pg，杂交信号强度与探针特异性活性呈正比，与探针长度呈反比。5、Southern杂交技术中的探针有几种？实验室常用什么？答：Southern杂交种使用的标记探针有同位素与非同位素标记两种。放射性同位素标记的探针灵敏度较高，但存在半衰期限制，并且实验验中操作者及环境都会受到放射性辐射的危害。所以实验室常用地高辛标记探针，目前市场已有相应的商品试剂盒，具体操作可以根据产品说明书进行。6、Southern杂交技术中使用地高辛探针方法时除按照商品说明书流程进行操作外，还需要注意

5、哪些技术要点？答：（1）探针的标记与使用：①地高辛方法最好用PCR方法制备探针，同时若是模板DNA量足够多，则可用随机标记法。PCR法制备探针有时会出现非特异条带，特异性降低，所以之前要对PCR条件进行优化以保证特异性；②要摸索探针的最适工作浓度。（2）DNA样品的准备：①DNA量要足够，一般不少于10μg，若产物中目的DNA浓度很大，则可适当按比例减少样品量；②电泳判断样品是否完全消化。（3）膜转移①当目的基因的含量较低或转移基因组时，采用向下转移法能够提高转移效率和检测信号的强度；②实验室一般采用紫外交联的方法对膜

6、上DNA进行固定，此法快速、方便，但是操作中要避免膜被过量照射，并且将膜上带有DNA的一面朝向紫外光源。此步是为了使DNA的一小部分胸腺嘧啶残基与膜表面带正电荷的氨基基团形成交联。（4）分子杂交：根据所选择的预杂交液确定杂交温度，在满足温度条件的情况下，杂交的成败取决于杂交时间，时间果断则杂交不充分；时间过长则可能导致非特异性结合增多。杂交时间一般控制在20小时左右。（5）祛除背景的方法：①适当延长梯度洗膜的时间和提高洗膜温度；②控制地高辛抗体的浓度。足够量的地高辛抗体可以获得较好的杂交信号，但过量的地高辛抗体会在膜上

7、产生非特异结合斑点。7、Southern杂交结果条带不清楚，可能是哪些方面的原因？答：（1）膜上DNA量少。A、酶切消化时，要使样品完全消化，通过定时做电泳检测；B、电泳上样量一般不能少于10μg；C、转膜后，若是不带电膜，则要进行固定DNA步骤，通过烘干、紫外照射等方法。（2）探针的灵敏度及浓度问题。A、探针选用不合适；B、探针的浓度不合适，可能偏低。（3）分子杂交步骤处理不当。A、分子杂交的时间不合适，可能偏短；B、杂交液量不合适，可能偏多；C、杂交环境温度不合适。8、Southern杂交结果底色颜色太重，怎么办？

8、答：（1）减少杂交时间；（2）减少探针的浓度；（3）增加凝胶及膜漂洗的次数及时间；（4）选用灵敏度更高的探针。9、蓝白斑筛选结果中只有白斑没有蓝斑，为什么？答：（1）可能是显色时间不够，平板培养一段时间后，要放置4℃冰箱8~12小时，蓝色才会慢慢显现；（2）连接部分出错，可能连接子大量自连，或是插入了其他小片段；（3）IPTG和X