应用CRISPR_Cas9基因编辑技术建立差异甲基化区CGI-2敲除小鼠.pdf

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1、硕士学位论文应用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立差异甲基化区CGI-2敲除小鼠ESTABLISHTHEDIFFERENTIALLYMETHYLATEDREGIONCGI-2KNOCKOUTMICEBYUSINGCRISPR/CAS9GENEEDITINGTECHNIQUE陈健哈尔滨工业大学2018年6月国内图书分类号：Q71学校代码：10213国际图书分类号：577.21密级：公开理学硕士学位论文应用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立差异甲基化区CGI-2敲除小鼠硕士研究生：陈健导师：韩正滨副教授申请学位：理学硕士学科：生物学所在单位：生命科学与技术学院答辩日期：2018年6月授予学

2、位单位：哈尔滨工业大学ClassifiedIndex:Q71U.D.C:577.21DissertationfortheMasterDegreeinScienceESTABLISHTHEDIFFERENTIALLYMETHYLATEDREGIONCGI-2KNOCKOUTMICEBYUSINGCRISPR/CAS9GENEEDITINGTECHNIQUECandidate：JianChenSupervisor：AssociateProf.ZhengbinHanAcademicDegreeAppliedfor：MasterofScienceSpeciality：BiologyAffiliatio

3、n：SchoolofLifeScienceandTechnologyDateofDefence：June,2018Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology哈尔滨工业大学理学硕士学位论文摘要Dlk1-Dio3印记区是小鼠基因组中一个重要的印记基因簇，存在多个蛋白编码基因、长非编码RNA基因，以及为数众多的microRNA和snoRNA基因。此印记区间基因的印记表达对于胚胎发育十分重要。深入研究此印记区基因的表达调控及作用机制，对于揭示印记基因在胚胎发育中的作用及获取高质量iPS细胞具有重要意义。而目前的研究仅限于三个已知的

4、父本甲基化的差异甲基化区（IG-DMR,Gtl2-DMR和Dlk1-DMR）对该印记区的基因表达调控。因此，寻找和鉴定新的差异甲基化区对进一步解析此印记区的基因调控机制及分子机理具有重要意义。结合本实验室前期研究发现的一个新的差异甲基化区CGI-2，本课题利用新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9，建立差异甲基化区CGI-2敲除小鼠。我们首先设计并制备了用于sgRNA体外转录的模板和Cas9体外转录模板，然后通过显微注射方式注射到小鼠受精卵中，并将其培养至囊胚，然后移植到假孕母鼠子宫内，成功获得了一只Founder（首建小鼠）。最终移植了64枚囊胚，获得5只新生小鼠，经鉴定，有1只CGI-2

5、单等位敲除的小鼠，总阳性率为20%。我们将Founder小鼠与野生型ICR小鼠交配，产生后代中的CGI-2单等位敲除小鼠再与Founder小鼠交配从而得到CGI-2双等位敲除小鼠。我们对3种基因型小鼠（野生型小鼠、CGI-2双等位敲除小鼠和CGI-2单等位敲除小鼠）的体征和体重的变化做了对比，发现在出生一天时，三种基因型的小鼠没有明显差异，而从出生后第一周至第四周时，体重和大小逐渐出现差异，表现为：野生型小鼠的体重和身体较大，其次是CGI-2双等位敲除小鼠，最后是CGI-2单等位敲除小鼠。而三种基因型小鼠的组织HE染色结果显示，CGI-2双等位敲除小鼠和CGI-2单等位敲除小鼠与野生型小鼠对比

6、，肺泡间质可见大量的炎细胞，肺泡腔以及肺间质可见出血，属于支气管伴间质性肺炎及肺实变；肝细胞形态发生轻微改变；肾小球结构消失且周围炎细胞浸润，肾间质出现片状坏死的现象。该模型的建立为后续研究CGI-2的功能及其作用机制提供重要的工具，也可为其他重要基因体内功能研究提供技术借鉴。关键词：Dlk1-Dio3印记区域；差异甲基化区域；显微注射；CGI-2；CRISPR/Cas9I哈尔滨工业大学理学硕士学位论文AbstractTheDlk1-Dio3imprintingregionisanimportantimprintinggeneclusterinthemousegenome.Therearemu

7、ltipleprotein-codinggenes,longnon-codingRNAgenes,andnumerousmicroRNAandsnoRNAgenes.Theimprintedexpressionofthisimprintedregiongeneisimportantforembryonicdevelopment.In-depthstudyontheexpressionregulat