CRISPR_Cas9介导敲除小鼠胚胎成纤维细胞MMP-2基因

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1、分类号密级UDC单位代码10435硕士专业学位论文CRISPR/Cas9介导敲除小鼠胚胎成纤维细胞MMP-2基因CRISPR/Cas9mediatedMMP-2geneKnockoutinMouseEmbryonicFibroblasts研究生姓名李鹏辉指导教师刘焕奇教授第二导师郭世宁教授学位种类兽医硕士中国·青岛2018年6月QingdaoAgriculturalUniversityTheThesisofProfessionalMasterCRISPR/Cas9mediatedMMP-2geneKnockoutinMouseEmbryonicFibrobla

2、stsGraduatewithProfessionalMasterDegree：LiPenghuiMentor:Prof.LiuHuanqiSecondMentor:Prof.GuoShiningTypeofProfessionalDegree：MasterofVeterinaryMedicineAcademicfield：CollegeofVeterinaryMedicineQingdao.ChinaJune,2018独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其

3、他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日青岛农业

4、大学硕士专业学位论文摘要CRISPR/Cas9介导敲除小鼠胚胎成纤维细胞MMP-2基因摘要奶牛蹄叶炎是奶牛较为常见的一种疾病，影响牛场管理及奶牛的运动，也降低了奶牛的产奶量。MMP-2是一种蛋白水解酶，属于明胶酶，能够分解细胞外基质的多种成分，经过多年研究发现，MMP-2在蹄叶炎发病过程中发挥着重要的作用。但目前，MMP-2引发蹄叶炎的机制尚未得到阐明。CRISPR/Cas9基因编辑技术是由RNA引导的热门定点基因敲除技术，在设计与构建上比传统的ZFNs和TALENs样效应物核酸酶更为简单。因此，可用CRISPR/Cas9技术靶向定点敲除小鼠成纤维细胞的MMP

5、-2基因，便于研究该基因对成纤维细胞炎症反应的影响。本文对小鼠MMP-2基因设计了特异性的向导RNA（sgRNA），构建特异于小鼠MMP-2基因的CRISPR/Cas9表达载体，并将表达载体转染至小鼠胚胎成纤维细胞，利用嘌呤霉素筛选出转染成功的细胞；通过Westernblot检测细胞MMP-2蛋白的表达，检测MMP-2基因敲除效果，得到敲除MMP-2基因的小鼠胚胎成纤维细胞。结果表明：通过网址http://chopchop.cbu.uib.no/分析可得到靶向于小鼠基因组MMP-2基因的靶位点，从中选取三个sgRNA序列，分别命名为MMP-sgRNA1、MMP

6、-sgRNA2及MMP-sgRNA3。分别将三个sgRNA序列连接到载体上，得到特异于小鼠MMP-2基因的CRISPR/Cas9表达载体—lenticrisprv2-sgRNA1、lenticrisprv2-sgRNA2和lenticrisprv2-sgRNA3。经菌液PCR鉴定和PCR产物测序表明，载体构建成功。试验中优化了转染条件，分别使用9μL脂质体介导lenticrisprv2-sgRNA2和lenticrisprv2-sgRNA3各3μg时，当小鼠胚胎成纤维细胞生长密度为80～90%，转染时间达48h时，收集细胞、制备蛋白并进行Westernbolt

7、检测后，发现MMP-2蛋白表达量降低，表明MMP-2基因已被敲除，为进一步研究MMP-2基因的功能作用提供了条件。关键词：CRISPR/Cas9基因编辑技术；MMP-2；小鼠胚胎成纤维细胞青岛农业大学硕士专业学位论文AbstractCRISPR/Cas9mediatedMMP-2geneKnockoutinMouseEmbryonicFibroblastsAbstractLaminitisisacommondiseaseindairycows,affectingfarmmanagementandthemovementofdairycows,aswellasmi

8、lkproduction.Matrix