b群流脑新疫苗候选抗原nmb0315免疫效果的初步评价

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2、原生物学．．．－．＂、—心謀＞嗦譜所在学院．；医学院；；，．驅薇堵皆赏１．．，二。—五年五月１？議議——雌、，、讀趟．坟一＾薄灣鑛－＾．．＇＇遞：＾货麵；．．織部：；．；；讓盛施脊４＾＾＾＾１ＵＮＩＶ巨ＲＳｍｒＯＦＳＯＵＴＨＣＨＩＮＡＢ群流脑新疫苗候选抗原ＮＭＢ０３１５免疫效果的初步评价论文作者签名私表／申指导教师豁名：＾论文巧阅人１；卿文衔，主任技师，衡阳市中也医院评阀人２；赵飞酸，教授，硕导，南华大学医学院答辩委员会主席：万康林，研究员，博导，中国ＣＤＣ传染病预防控制所委员１

3、：尹跃平，研究员，博导，中国巧学稱挙院巧肤病研究所失舉明教授南隹大学民学院委员２：，，硕导，３：曾铁兵，教授，硕导，亩华大学医学院委员４，，，员：周洲副教授硕导南库大学民学院委２０１年月３日答辩日期：５５２B群流脑新疫苗候选抗原NMB0315免疫效果的初步评价摘要：[目的]研究原核重组表达的B群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白0315（rNMB0315）在诱导小鼠产生特异性免疫应答中的作用、免疫血清抗体体外杀菌活性和重组蛋白的免疫保护效果，初步评价rNMB0315作为B群流脑疫苗候选抗原的潜力。[方法]以B群脑膜炎奈瑟菌

4、标准株MC58基因组DNA为模板，PCR扩增NMB0315基因，克隆至pET-30a原核表达载体中，经BamHI和XhoI双酶切及测序鉴定重组质粒。将构建成功的原核重组表达载体pET-30a/NMB0315转化大肠杆菌BL21中大量表达重组蛋白，经His亲和层析纯化重组蛋白，Western-blot鉴定其抗原性，反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析rNMB0315蛋白的纯度。纯化鉴定后的重组蛋白经腹腔注射免疫雌性BALB/c小鼠，采用间接ELISA法检测蛋白疫苗免疫小鼠血清中抗NMB0315特异性总IgG及其亚类抗体水平、小鼠生殖道黏膜

5、分泌物中抗NMB0315特异性sIgA抗体水平及经rNMB0315刺激后小鼠脾淋巴细胞上清液中IFN-γ、IL-4水平，CCK8法检测小鼠的脾淋巴细胞增殖刺激指数（SI）；按一定比列混合乳兔补体、免疫血清及生长至对数期的MC58菌液，测定免疫血清体外杀菌效价；观察NMB0315重组蛋白疫苗对感染B群脑膜炎奈瑟菌雌性BALB/c小鼠的免疫保护效果。[结果]成功构建了原核表达重组载体pET-30a/NMB0315。rNMB0315蛋白能在培养上清中以可溶性状态表达。rNMB0315具有良好的免疫原性，能诱导产生较高水平的体液免疫应答：包括血清特

6、异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG3、IgG2b和生殖道黏膜特异性sIgA，免疫后第6周抗体效价分别为1:150,000、1:85,000、1:60,000、1:35,000、1:30,000和1:30,000；I在rNMB0315免疫的2、4、6周，血清IgG2a/IgG1的比值分别为0.673，0.810，0.685，比值均小于1。rNMB0315也能诱导产生较高水平的细胞免疫应答，疫苗免疫第6周，小鼠脾淋巴细胞增殖反应SI值（1.56±0.056）明显高于PBS（0.146±0.032）、FA（0.310±0.044）对照组(P

7、<0.001)。与反映体液免疫有关的细胞因子IL-4（210.86pg/mL）和反映细胞免疫有关的细胞因子IFN-γ（157.59pg/mL）的水平，FA+rNMB0315组均明显高于PBS、FA（Freundadjuvant，FA）对照组(P<0.001)。rNMB0315疫苗免疫血清在补体介导下的体外杀菌抗体效价为1:128，72小时内对实验小鼠的免疫保护率为90%。[结论]1.原核表达的rNMB0315具有良好的免疫原性，能诱导实验小鼠产生高水平的体液免疫和细胞免疫，且以Th2倾向性体液免疫应答为主；也能诱导生殖道黏膜局部产生较高水平

8、的特异性sIgA抗体。2.rNMB0315疫苗对感染B群脑膜炎奈瑟菌的BALB/c小鼠具有良好的免疫保护效果；在补体介导下，末次免疫血清在体外具有较强的杀菌活性。关键词：B群脑膜