蛋鸡子宫内膜细胞钙转运及蛋壳钙化早期钙沉积机制的研究

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1、分类号：密级：学号：单位代码：石河子大学硕士学位论文蛋鸡子宫内膜细胞钙转运及蛋壳钙化早期钙沉积机制的研究学位申请人叶幼荣指导教师孙杰副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向动物遗传资源利用与分子育种所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2015年6月Theresearchofcalciumtransportinginchickenendometrialcellsandthemechanismsofcalciumdepositionininitialstageofeggshel

2、lcalcificationADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByYeYou-rong(AnimalGeneticsandbreeding)DissertationSupervisor:Pre-Prof.SunJieJune2015摘要目的：研究孕酮对蛋壳钙化初期与钙沉积相关的基质蛋白和基因表达的影响，初步探讨钙化起始时

3、的钙沉积机制。方法：本研究以产蛋高峰期蛋鸡作为实验动物，体外培养蛋鸡子宫内膜细胞，测定细胞生长曲线，检测不同浓度的激素对细胞体外增殖和钙离子浓度的影响，并利用实时荧光定量PCR技术2+（RTQ-PCR）检测不同处理组细胞中Cabp-d28k、Ca-ATPase、碳酸酐酶(CA)、TRPV6、骨桥蛋白(OPN)、卵铁传递蛋白(Ovotransferrin)、卵清蛋白(Ovalbumin)、Ovocleidin17和凝集素(Clusterin)等基因的表达量变化。在此基础上对蛋鸡进行孕酮和孕酮受体拮抗剂处理，

4、蛋壳钙化初期（排卵后4.5-5.5h）采集子宫组织和蛋壳，扫描电子显微镜（SEM）观察蛋壳超微结构变化，测定子宫中钙离子浓度及相关基因表达量的变化规律，对基因的表达量变化与超微结构的相关性进行分析，并采用免疫组化和免疫印迹（Western-Blotting）分析Cabp-d28k和Ovalbumin蛋白在子宫中的变化。结果：本研究成功培养了蛋鸡子宫内膜上皮细胞和基质细胞，并测得两种细胞的生长曲线；添加100nM的孕酮能显著（P<0.05）促进上皮细胞和基质细胞的体外增殖；激素对体外培养的细胞中钙离子浓度的

5、影响不显著（P>0.05），但鸡体经孕酮处理后子宫组织中的钙离子含量显著（P<0.05）下降。不同处理对子宫内膜细胞和子宫组织中基因的表达量影响为：孕酮处理后Cabp-d28k、CA和OPNmRNA在子宫中的表达量显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）下降，OVA、Clu和OC17mRNA的表达量显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）升高；孕酮受体拮抗剂处理后TRPV6mRNA的表达量显著（P<0.05）下降，OVA、OVO、Clu和OC17mRNA的表达量显著（P<0.05）或极显著（P<0

6、.01）升高。与对照组和拮抗剂处理相比，孕酮处理后蛋壳内膜层和乳突层变厚，纤维直径和结节直径变大，乳突间隙和纤维间隙变小，差异均达到显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）水平，且孕酮处理后Cabp-d28k、OVA、OVO以及OPN等基因的表达量变化与蛋壳超微结构有相关性；免疫组化和WesternBlotting分析结果表明，Cabp-d28k和Ovalbumin蛋白在不同处理组的子宫中均有表达，但Cabp-d28k蛋白在孕酮处理组中的表达量低于对照组和孕酮受体拮抗剂处理组，Ovalbumin蛋白则

7、相反。结论：蛋壳钙化初期孕酮显著（P<0.05）抑制了Cabp-d28k和OPN在子宫中的表达，使蛋壳的乳突面积、乳突直径和纤维间隙减小；孕酮显著（P<0.05）促进了OVA和OVO的表达，使蛋壳的纤维径和结节直径增加；且使蛋壳内膜层厚度和乳突层厚度增加。研究认为蛋壳钙化初期孕酮可通过调控蛋鸡子宫中与钙化相关的基因和蛋白的表达，使蛋壳纤维内膜层和乳突层结构更致密，排列更有序，从而使增加蛋壳强度。本研究为蛋壳钙化时钙沉积的机制的进一步研究提供了理论依据和实验基础。关键词：蛋鸡，孕酮，蛋壳钙化，钙转运蛋白，基

8、质蛋白IAbstractObject:Weinvestigatetheeffectofprogesteroneontheexpressionsofproteinsandgenesinthechickenuterus,andresearchthemechanismofcalciumdepositionintheearlystageofcalcification.Methods:Inthepresentstudy,chickene