蓖麻蚕pcrace1的克隆与表达分析及在辛硫磷胁迫下的表达变化

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1、学校代码：10289分类号：S885.2;Q78密级：公开学号：129310005江苏科技大学硕士学位论文蓖麻蚕Pcrace1的克隆与表达分析及在辛硫磷胁迫下的表达变化研究生姓名陈立华导师姓名张月华申请学位类别硕士学位授予单位江苏科技大学学科专业养殖论文提交日期2015年4月20日研究方向分子生物学论文答辩日期2015年6月3日答辩委员会主席赵巧玲评阅人匿名评审2015年6月3日分类号：S885.2;Q78密级：公开学号：129310005农学硕士学位论文蓖麻蚕Pcrace1的克隆与表达变化及在辛硫

2、磷胁迫下的表达变化学生姓名陈立华指导教师张月华副研究员江苏科技大学二O一五年六月AThesisSubmittedinFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureCloneandsequenceanalysisofAcetylcholinesterasegeneanddetectionofit’schangesofexpressionunderthestressofthephoximSubmittedbyNameChenLi

3、huaSupervisedbyProfessorNameZhangYuehuaJiangsuUniversityofScienceandTechnologyJune,2015江苏科技大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：年月日

4、江苏科技大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于：(1)保密□，在年解密后适用本授权书。(2)不保密□。学位论文作者签名：指导教师签名：年月日年月日摘要摘要蓖麻蚕(Philosamiacynthiaricini)是鳞翅目大蚕蛾科的一种

5、泌丝昆虫，既是重要的经济昆虫，同时也是优良的分子遗传研究生物。对蓖麻蚕内参基因的筛选、蓖麻蚕乙酰胆碱酯酶基因（Pcrace1）的克隆和蓖麻蚕对辛硫磷农药抗性的研究，为今后从分子水平上阐明蓖麻蚕的代谢途径，研究有关蓖麻蚕的经济性状、生长发育调节和重要的抗病基因奠定重要的基础，同时对开展蓖麻蚕抗药性研究，减少蚕业生产中的农药中毒具有一定的的实用意义。1、蓖麻蚕基因转录表达分析的内参基因筛选分别对蓖麻蚕的4个组织及9个不同发育时期的个体材料进行实时荧光定量PCR，制作标准曲线，采用相对定量的方法处理Ct值

6、，结合NormFinder和geNorm软件分析4个候选内参基因肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、18SrRNA和16SrRNA在蓖麻蚕不同组织和不同发育时期转录表达的稳定性。结果表明肌动蛋白基因在蓖麻蚕血液、脂肪体、中肠、丝腺各组织以及蓖麻蚕幼虫、蛹、成虫、卵各发育时期的表达最为稳定，适合作为蓖麻蚕基因转录研究的内参基因。2、蓖麻蚕乙酰胆碱酯酶基因（Pcrace1）cDNA片段的克隆和表达分析利用RT-PCR和RACE技术从蓖麻蚕幼虫头部组织克隆了乙酰胆碱酯酶基因（Pcrace1），克隆的cDNA

7、片段长度为2374bp，开放阅读框(ORF)的长度是2067bp，5’端和3’端分别含有207bp和100bp的非翻译区，编码688个氨基酸残基，编码的蛋白质的相对分子量为77.7kD，等电点为6.275。基于乙酰胆碱酯酶同源氨基酸序列的系统分析表明，蓖麻蚕与小卷蛾的亲缘关系最近。蓖麻蚕Pcrace1基因在5龄第三天幼虫的头部、脂肪体、血液均有表达，以头部表达量最高。不同发育时期以5龄表达量最高，1龄表达量最低。3、蓖麻蚕对辛硫磷农药抗性研究将40%的辛硫磷原液稀释成35mg/L～70mg/L浓度区

8、间的8个浓度梯度，采用浸叶法测定了辛硫磷对于5龄第3天蓖麻蚕24h的LC50，蓖麻蚕对40%辛硫磷乳油的LC50(24h)为51.81mg/L。利用实时荧光定量PCR方法检测添食50mg/L辛硫磷后Pcrace1和Pcrace2在血液、脂肪体、中肠、丝腺、头部等不同组织中的表达变化，结果表明在添食辛硫磷之后，Pcrace1和Pcrace2在各组织中的表达都有变化，其中1江苏科技大学农学硕士学位论文Pcrace1在头部和脂肪体的转录表达变化量分别比对照组上调10.66倍