草鱼白细胞介素1β的克隆及其在肠道炎症中的功能鉴定

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1、论文题目草鱼白细胞介素1g的克隆及其在肠道炎症中的功能鉴定研究生姓名卜云璇指导教师姓名宋学宏专业名称水生生物学研究方向水生生物制品安全性论文提交日期2015年5月苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：卜云布^曰期：苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关

2、于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在____年__月解密后适用本规定。非涉密论文@论文作者签名：卜泛旋曰期：导师签名：泉汉B期：_f--------------------草鱼白细

3、胞介素1β的克隆及其在肠道炎症中的功能鉴定中文摘要草鱼白细胞介素1β的克隆及其在肠道炎症中的功能鉴定中文摘要目的：白细胞介素-1β（IL-1β）是一种促炎细胞因子，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，可参与机体的多种生理及病理反应，在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等过程中发挥重要作用。草鱼是我国重要的淡水养殖经济鱼类，但其易遭受多种病原菌和病毒的危害，病原生物通常通过肠道进入草鱼体内，使其发生炎症乃至死亡，造成经济损失。本研究旨在通过克隆草鱼IL-1β基因，分析其基因结构，明确其在草鱼生理及病理条件下的各组织的表达水平，揭示该基因在肠道炎症发生过程中的可能作用。方法

4、：运用RACE技术从草鱼中克隆IL-1β全长cDNA，通过pET32a(+)原核表达系统表达IL-1β融合蛋白，并经镍柱纯化获得具有生物活性的蛋白。运用qPCR技术分别检测：（1）健康草鱼各组织的IL-1β转录水平；（2）用细菌内毒素（LPS）腹腔注射草鱼后4h，12h，24h和48h时各组织中IL-1β相对表达量。（3）肛灌不同剂量重组IL-1β活性蛋白后炎症发生过程中肠道组织内的IL-1β、IL-1R2和TNF-α基因相对表达水平。以割胶纯化的草鱼IL-1β重组蛋白为免疫原，制备草鱼IL-1β多克隆抗体，用琼脂双扩散法检测抗体的效价、Westernblot验证其特异性

5、。采用肛灌嗜水气单胞菌诱导草鱼产生肠道炎症，诱导12h后肛灌20ng/尾的草鱼IL-1β多克隆抗体（rgcIL-1βpAb），用qPCR检测肠组织中IL-1β、IL-1R2和TNF-α基因在肠炎发生过程中的表达变化。采用免疫组化技术观察多抗处理3d后草鱼肠道内天然IL-1β蛋白分泌特征。结果：草鱼IL-1cDNA全长为1260bp，包含一个813bp的开放阅读框，编码长度为270个氨基酸的多肽，预测的分子量为30.1kDa，氨基酸序列具有IL-1家族特征性序列，但缺乏哺乳动物中保守的典型IL-1转换酶裂解位点。草鱼IL-1基因组DNA长2863bp，由7个外显子和6

6、个内含子构成。系统进化树分析结果显示，草鱼和其他鲤科鱼类的IL-1归为单独的一支。健康草鱼肌肉、肝脏、肠道、皮肤、鳍、心脏、脑、体肾、头肾、鳃和脾脏等11种组织中均有IL-1表达，脾脏、鳃、I中文摘要草鱼白细胞介素1β的克隆及其在肠道炎症中的功能鉴定头肾和体肾中其转录水平相较其他组织高，经LPS刺激鱼体后，IL-1β转录水平在肌肉、肝脏、肠道、皮肤、体肾、头肾和鳃中显著上调；其中，肌肉、皮肤、鳍和脾脏四种组织的IL-1β表达在12h时上调至最高后随即下降，而另外6种组织在24h时上调至最高，随后下降。不同浓度的草鱼IL-1β活性重组蛋白灌肠后，IL-1βmRNA水平显

7、著上调，在刺激24h时达到最高，且5μg/尾鱼剂量表达量最高，72h时则下降；相应的，受体基因IL-1R2及下游基因TNF-αmRNA的表达也上调，其变化趋势与IL-1β基本一致。琼脂双扩散显示，所获多抗的效价为1:32；Westernblot结果显示，所制备的多克隆抗体可特异性识别草鱼IL-1β蛋白。用嗜水气单胞菌肛灌诱导的草鱼肠道炎症12h后肛灌草鱼IL-1β多克隆抗体，可降低IL-1β、IL-1R2及TNF-αmRNA的表达，减少肠道中IL-1β蛋白分泌量，减轻肠道炎症。结论：我们克隆并鉴定了草鱼IL-1β。该研究证实，