猪丹毒丝菌保护性抗原筛选及鉴别诊断elisa方法初步建立

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1、硕±学位论文詹猪丹毒丝菌保护性抗原節选及鉴别诊断ＥＬＩＳＡ巧去初步建立．＇－；：？？．＇．，■，研究生姓名刘晓波指导教师余兴龙教授．学科专业预防兽睽学：Ｋ＼研究方向病原分子生物学与免疫学－－Ｉ－謂４国分类号ｓ％密级ＵＤＣ单位代码１０５３７顯斋农巫乂＃硕±学位论文猪丹毒雙菌保护性抗原筛选及鉴别诊断ＥＬＩＳＡ方法初步建立Ｓｃｒｅｅｎｐｉｎｇｏｆｔｈｅｒｏｅｃｔｉｖｅａｎｔｉｅｎａｎｄｐｐｇｄｅｖｅｌｏｉｎａｄｉｆｆｅｒｅ

2、ｎｔｉａｎｔｅＥＬＩＳＡｆｏｒａｎｔｉｂｏｄｙｏｆｐｇＥｒｙ研究牛巧名刘晓波指导教师余兴龙教授学科专化预防兽医学研究方向病原分子生物学与免疫学、论义答辩日期２０５－０５－３１答辩委员会主席＿＿＾、论文评阅人，稀华新、忘伸秦￣￣￣—Ｔ独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在指导教师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的学位或证一书而使用过的材料。与我同工作

3、的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。心／研究生签名：年＾月日：时间关于论文使用授权的说明本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，并同意将由此产生的收益捐赠给学校教育基金会用于发展研究生教育。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）■Ｗ／ｉ：研究生签名时间：ｐ年＾月／一０指导教师签

4、名时间年月１化＾摘要摘要本研究从猪红斑丹毒丝菌全基因组水平着手，选择可编码金属转运相关蛋白、表面蛋白、膜蛋白、脂蛋白的阅读框进行跨膜区域分析、信号化分析后设计５１对引物。利用ＰＣＲ基因克隆技术对选取蛋白进行基因克隆表达，经过ＰＣ民扩増、酶切、连接、转－２８ａ化后用特异性引物检测，结果显示５１个基因片段成功插入ｐＥＴ＋载体。将构建好（）３－的重组质粒转入大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ）中进行诱导表达，经ＳＤＳＰＡＧＥ电泳鉴定显示有２３个蛋白成功得到表达，其中包括１４个可溶性表达蛋白及９个包涵体表达蛋白。２３ｕ－（即ｓｕｒｒｏｅｃｔ

5、ｖｅａｎｅｎ对个蛋白进行小鼠免疫保护试验，最终显示Ｓ１ｆａｃｅｔｉｔｉ，ｐｇ一ＳｐａＡ）与丹毒丝菌商品苗免疫组的保护率致，均达到１００％保护；同时ＳｕｒｆａｃｅｒｏｔｅｉｎｐＡａＳｕ－２－２蛋白与Ｓｕ－２－４Ｌ－２（Ｓｐ）节段表达的蛋白Ｗ及脂蛋白ｐ蛋白免疫组小鼠也有一１７％的存活率，也显示了定的免疫保护效果。本实验室对ＳｐａＡ氨基端的免疫保护区域构建重组ＳｐａＡ－Ｎ蛋白并对其进行了小鼠ａ－Ｎ蛋白对小鼠１００％攻毒保护试验，结果显示了却有的保护率。本研究Ｗ该重组蛋白制备Ａ，，１（０Ｈ）３佐剂亚单位疫苗并进行猪的免疫攻毒试验对免

6、疫猪进行丹毒丝菌１００％的保护性－攻毒也显示了，结果表明ＳｐａＮ蛋白丹毒丝茜亚单位疫苗候选蛋白具有一定的可行性，。亚单位疫苗诱导机体产生的抗体为疫苗所含抗原对应的抗体而野毒感染产生的抗体比较复杂一种评估方法用来鉴别诊断丹毒丝菌野毒感，因此可建立ａＡ－Ｎ免疫抗体０染抗体与Ｓｐ，本研究选取１个可溶性表达且表达量高的蛋白作为候选包被抗原包被ＥＬＩＳＡ反应板检测丹毒丝菌感染猪血清，结果显示自然感染丹毒丝菌猪Ｆｅ－２蛋白包被ＥＬＩＳＡ抗原板产生较强的反应－两周后采得血清就能与，且Ｆｅ２蛋白包被ＥＬＩＳＡ抗原板与大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、副

7、猪嗜血杆茵、己氏杆菌、沙口氏菌等细菌制备的商免血清的特异性试验显示其有较好的特异性，最终选定对丹毒丝菌自然感染血清反应值较好的Ｆｅ－２蛋白作为鉴别诊断丹毒丝菌野毒感染抗体与ＳａＡ－Ｎｐ免疫抗体的包被抗原，通过实验优化ＥＬＩＳＡ条件为：抗原包被量ｌＯＯｎｇ／孔，血清稀释倍数１／１００，血清作用时间、酶标二抗作用时间均为３０ｍｉｎ，底物作用时间１５ｍｉｎ。ＳＡ关键词：丹毒丝菌；保护性抗原筛选；鉴别诊断；ＥＬＩＩ湖南农业大学硕±学位论义ＡｂｓｔｒａｃｔＯｕｒｒｅｓｅａｒｃｈｓｅｌｅｃｔｅｄ５１ｍｅｔａｌｔｒａｎｓｐｏｒｔ

8、ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔ；ｅｉ