长臀鮠精子形态和差异蛋白及dmrt1与vasa基因的研究

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1、分类号Q953+.3学校代码10564UDC学号2012106701密级博士学位论文长臀鮠精子形态和差异蛋白及DMRT1与VASA基因的研究陈金涛指导教师姓名邹记兴教授申请学位级别博士专业名称水生生物学论文提交日期2015年6月论文答辩日期2015年6月学院名称动物科学学院学位授予日期2015年6月答辩委员会主席王安利教授摘要长臀鮠Cranoglanisbouderius（Richardson）是近年来开始人工驯养的名贵经济鱼类养殖新品种。但到目前为止，长臀鮠规模化人工繁殖技术一直没有取得突破，野生种质资源已枯竭。针对长臀鮠自然水体中能实

2、现繁殖，而人工养殖条件下，人工繁殖雌雄配对困难、受精率低下等技术瓶颈问题，本研究计划从长臀鮠精子的相关生物学特性开展研究，包括长臀鮠精子分离纯化及形态观察、差异蛋白及性别决定与分化相关基因DMRT1及VASA的表达特征。期望通过本研究为解决长臀鮠人工繁殖技术瓶颈问题提供理论支持，探索出的方法可作为其它人工繁殖困难鱼类相应研究时的参考。本论文采用的方法及其研究结果包括：①利用密度梯度角转离心对长臀鮠精子进行分离纯化，结果表明采用3层（30%，60%及70%）非连续Percoll密度梯度离心能高效的分离纯化长臀鮠精子，纯化后的精子保持较高的活

3、力，细胞膜也较完整。②通过光学显微技术结合电子显微镜观察，长臀鮠精子分为头部、中段、尾段鞭毛三部分。在透射电子显微镜下，精子头部为核物质部分，其细胞核为马蹄形，有植入窝、核泡，无顶体、顶体囊。精子中段充满了细胞质及细胞器：细胞质中发现有胞质通道，胞质通道中存在囊泡与鞭毛基融合现象，可能参与了微管的转运与组装；细胞器中的中心粒复合体位于植入窝中央，彼此呈锐角排列。精子尾段鞭毛具有典型的9+2结构，为无侧鳍单鞭毛。长臀鮠精子发生属Ⅲ型。③通过iTRAQ技术对长臀鮠成熟精子及未成熟精细胞进行差异蛋白研究。总共鉴定到1941个可信蛋白质，其中差异

4、蛋白有361个，157个上调，下调204个。分别根据GeneOntology数据库的注释对蛋白质的亚细胞定位和分子功能以及各种蛋白参与的生物学过程进行分析，针对存在的差异蛋白进行了初步探讨。经KEGGPathaway注释对蛋白质的信号通路进行分析，共涉及235种信号通路，为深入研究精子发生的分子机制提供了丰富的信息，其中TCA信号通路与精子能量代谢有关，共有5种差异蛋白：IDH、PEPCK、α-KGDHC复合体（OGDH、DLST和DLD）。EABB信号通路涉及的PLCγ、PAK、Raf及GSK-3差异蛋白均对精子发生有重要作用。④利用R

5、ACE方法克隆得到了长臀鮠DMRT1及VASA基因全长cDNA，DMRT1基因存在3个转录本，分别命名为cbDMRT1a、cbDMRT1b、cbDMRT1c，三者之间I最主要差别表现在3′UTR区，DM结构域高度保守。VASA基因存在2个转录本，分别命名为cbVASAa、cbVASAb，两者仅在5′UTR上存在差异，DEAD-box结构域同源保守性极高。不同的转录本间可能存在选择性剪切，参与不同生理调控过程。通过荧光定量PCR对DMRT1基因的表达模式研究，发现其在性腺中特异表达，精巢表达量大大高于其它组织。通过FISH原位杂交法分别以D

6、MRT1三个转录本及VASA基因设计。杂交结果显示长臀鮠DMRT1基因的三个转录本在精巢中生殖细胞中有大量表达，包括精原细胞和精细胞；cbDMRT1b和cbDMRT1c在除了精巢生殖细胞外其他组织中均有较强的杂交信号；cbDMRT1c主要在精原细胞中分布。而这三者在卵细胞中也有微弱表达，且表达的趋势是随着卵细胞的发育逐渐从细胞质向细胞核内转移。VASA基因在长臀鮠性腺中有较高的表达量，其表达模式为在卵巢的Ⅰ、Ⅱ时相的卵母细胞中有较强的杂交信号，在整个卵母细胞的细胞质中均匀分布。随着卵母细胞的发育，Vasa的杂交信号逐渐衰减直至消失。在精巢

7、中也有相同的趋势，在精原细胞中检测得到较强杂交信号，在精细胞中信号消失。充分表明这两个基因可能直接参与生殖细胞的早期分裂和发育的过程并在其中起重要作用，而对生殖细胞后期的发育和成熟则更多的起调控的作用。关键词：长臀鮠；精子；差异蛋白；DMRT1；VASAIIMorphologyandDifferentialProteinsofCranoglanisbouderiusSpermandInvestigationofDMRT1andVASAJintaoChen(CollegeofAnimalSciences,SouthChinaAgricult

8、uralUniversity,Guangzhou510642,China)Abstract：Cranoglanisbouderius(Richardson)isarareeconomiccul