胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白的设计与改造

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1、分类号密级博士学位论文题目：胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白的设计与改造英文并列题目：Drugdesignandreconstructionofglucagon-likepeptide-1withhumanserumalbuminfusionprotein研究生：钱凯专业：发酵工程研究方向：生物制药导师：金坚指导小组成员：陈蕴蔡燕飞学位授予日期：二〇一五年十二月三十一日答辩委员会主席：李华钟教授江南大学地址：无锡市蠡湖大道1800号二〇一五年十二月II摘要摘要胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是一种由肠道L细胞分泌的糖调节激素。主要生理活性是在

2、机体高血糖时，刺激β胰腺细胞分泌胰岛素，而在血糖正常时而不分泌胰岛素而避免引发低血糖。GLP-1是很好地治疗II型糖尿病的潜在生物蛋白。但由于GLP-1在体内代谢的特殊性，对于维持生物蛋白的稳定性和保持生物蛋白的活性成为研究的热点。课题组前期研究结果显示，GLP-1二联体与人血清白蛋白（HSA）N端连接的GGH融合蛋白在毕赤酵母中表达，生物蛋白半衰期从20min提高至57.8h。与HSA融合后的GLP-1类似物（GGH）的稳定性得到了明显的提高，但活性不高。本论文以课题组前期研究为基础，首先，构建GLP-1突变体体外检测的细胞模型，并设计GLP-1的

3、突变体。其次，在毕赤酵母（P.Pastoris）表达系统中，对信号肽剪切酶位点的设计、与HSA融合时优化GLP-1串联体的数目及在N端添加His-tag的方式，从三方面对GLP-1类似物（GGH）进行设计，以提高GLP-1类似物的比活性。然后，将在毕赤酵母表达系统中高活性的生物蛋白在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）进行表达，增加GLP-1类似物成药性的可能。最后，对CHO细胞表达的GLP-1类似物（GGH）参照药典的一般要求进行质量检测，并探索GLP-1类似物（GGH）的定向分化活性。实验结果如下。(1)为GLP-1类似物筛选提供一种简单可靠的评价方法，构

4、建一种体外检测的细胞模型。经单克隆筛选和遗传霉素压力筛选最终筛选获得一株高表达的细胞模型（CHO/pcDNA3.1/hGLP-1R）。RT-PCR、流式细胞仪检测结果和激光共聚焦结果显示该细胞模型株构建成功。活性检测结果显示该细胞模型可以很好地用于GLP-1类似物活性的检测，且较野生的细胞模型株（RINm5f）的响应值高、培养方便。为设计获得新颖的GLP-1类似物，化学合成5种GLP-1类似物。突变的GLP-1类似物经体外细胞活性检测显示，与阳性对照组相比最大半数有效浓度提高23倍以上。因此，突变的GLP-1类似物的成药性不强。(2)实验室前期构建的

5、菌株（P.Pastoris/pPIC9K/GGH）是甲醇氧化酶（AOX1）启动子表达的菌株，保留了Kex2和Ste13两种信号肽剪切酶位点，表达的蛋白简写为AOX/GGH。在P.Pastoris表达系统中对生物蛋白进行改造和设计，结果如下。1.为消除甲醇对酵母的毒副作用，将GGH利用甘油醛三磷酸脱氢酶（GAP）启动子在P.Pastoris表达。结果显示，利用GAP启动子和AOX1启动子的表达GGH的产量和活性相当，但GAP启动子的发酵时间缩短了20h，且GAP启动子的发酵培养过程更加简单方便。2.为消除剪切位点不专一的Ste13信号肽剪切酶位点，将S

6、te13位点去除而只保留Kex2位点。去除Ste13酶切位点后，GLP-1类似物（GGH）的比活性较提高到1.45倍，但表达量却下降了31%。3.为研究GLP-1与HSA融合蛋白时GLP-1最佳串联体数目，以及为获得N端均一的蛋白。将GLP-1与HSA的融合蛋白的N端添加His-tag，并在其后III摘要添加肠激酶（enterokinase，EK）的蛋白酶酶切位点。设计GLP-1的单体，二联体，三联体分别与HSA的N端融合连接（GH、GGH、GGGH），同时考察融合蛋白前面添加一个保护氨基酸（A，ala）对活性的影响。实验结果显示，GLP-1二联体与

7、HSA的融合的方式能减少HSA对GLP-1空间构型的影响，而能最好地保留GLP-1类似物活性。同时，通过His-tag再经肠激酶酶切获得的9K/GGH较AOX/GGH的N端更加均一、纯化回收率为提高50%，且生物蛋白的比活性提高到4.66倍。(3)为提高突变的GLP-1类似物（GGH）的活性和减少生物蛋白的免疫原性，将P.Pastoris筛选最优的融合蛋白在哺乳动物细胞CHO中表达，同时设置对照实验。经过四个循环的细胞株筛选，获得三株重组细胞株CHO/pMH3/GGH、CHO/pMH3/AGGH和CHO/pMH3/NGGH，细胞稳定性结果显示筛选获得

8、的细胞株为稳定表达的单克隆细胞株。WB验证验证后在3L的流加瓶放大培养。CHO/GGH、CHO/AGGH、C