试析紫草细胞的固定化培养与优化研究

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1、浙江大学博士学位论文紫草细胞的固定化培养与优化研究姓名：薛莲申请学位级别：博士专业：化学工程指导教师：吕德伟;孟琴1999.12.6摘要摘要本文研究了紫草细胞悬浮培养中培养基中多种成分对细胞生长与次尘代谢产物合成的影响，进行了结构化的动力学模型研究；通过选择合适的有机溶剂对紫草细胞进行了双液相培养研究；通过确定以吸附为细胞的固定化方法，进行了生物活性吸附载体的制备与固定化细胞的制备研究；并结合双液相培养技术，对紫草细胞进行了固定化培养及其动力学模型的研究：对反应器进行选型，并进行冷模与热模研究；在反应器中进

2、行了固定化紫草细胞的双液相培养条件下的流加操作研究。f首先，研究了紫草悬浮培养过程中的基质消耗、细胞生长与产物合成情况。铡定了在细胞所处的不同培养阶段，培养基中的碳源、氮源、磷酸盐和金属元素等的消耗，分析了其不同的消耗特征。其二，研究了在悬浮培养中存在的碳源抑制现象。发现培养基中初始蔗糖浓度的最优值为179／L，此时紫草宁产率分别达到O．07199／g干重细胞和0．1529／g接种干重细胞。紫草宁的转化率达7．92％。在对紫草的动力学和碳源抑制的研究基础上，建立了紫草细胞悬浮培养的结构化动力学模型。我们以碳

3、源的代谢走向为依据，采用了含有l5个参数与9个状态变量的方程组来描述细胞悬浮培养过程中胞外碳源、胞内碳源、胞内结构性组分、胞内中间物质、细胞呼吸损失和胞内外产物的变化情况，从而对细胞的生长和代谢有了更深入的理解。模型方程组如下：旦＆⋯k旦．塑讲4矿以∥兰+&扣‰“d’争再Se^I’争再Fe扣⋯口’争甭Se也’争再Ge!塑坚查堂堕主堂垡堡苎一——扣∥争巧Fe吨‘争再ae心一一’矿V⋯_【I一剖Ci‘尹V⋯r’等’iC知i丢厨=[k—t。：一女，．(1一最)】·万V·Ci·厨急s汹。·和国吨圆dRi=k,’争i

4、C莎i．蜥研丢州卜老H卜肌Ci，-kp’弘协小c肌罢恤，丢ttPe咄‘(号删一心)这是首次采用结构模型描述紫草细胞的悬浮培养动力学。在结构化动力学模型的研究基础上，我们确定了双液相与固定化培养技术、流加技术在紫草细胞培养中应用的可行性，并为后继的研究工作奠定了理论基础。在双液相培养研究中，首先对有机溶剂进行了物性研究，在理论上预测了适合于细胞双液相培养的有机溶剂。通过实验，选择了采用液体石蜡这一相对成本较低的有机溶剂作为紫草细胞双液相培养的第二相。通过对液体石蜡的添加比例与加入时间的研究，发现采用1：5的添

5、加比例，在培养起始时在培养基中添加液体石蜡对紫草细胞进行双液相培养，紫草宁的终产率可提高至普通悬浮培养产率的3．8倍，此时紫草宁的外泌率达到95．7％，远高与普通悬浮培养的产物外泌率23．8％。我们对双液相培养的氧传递与产物传递机理进行了研究，证明了溶剂的存在加强了氧的传质：溶剂通过对产物的萃取降低了胞内产物的浓度，从而减小了产物抑制的不良影响。有机相的添加并不改变细胞生长与代谢的动力学参数。液体石蜡对细胞生长与产物合成产生的影响是基于其物理毒性即对营养物的吸收阻碍和它对产物紫草宁的萃取减小了产物抑制的不良

6、作用这两个因素。在细胞固定化培养研究中，我们首先通过对细胞固定化方法的比较，选摘要择了以吸附作为紫草细胞的固定化方法。从霉菌细胞壁中制备了具有活性的生物吸附载体，对吸附固定化操作进行了研究。在采用2．59／L、pH为5．6的果胶酶液对细胞进行分散处理后，在25℃、pH为5．6条件下对细胞进行吸附固定化，载体对紫草细胞的吸附率可达19／g以上。将固定化细胞置于培养基中，在300r／min的搅拌速率下搅拌l5min，未发现细胞脱附现象。由于载体的尺寸在10-3m以下，因此固定化细胞中几乎不存在内扩散，大大减小了

7、固定化材料对传质的不良影响。且固定化细胞的形态使我们便于采取流态化操作。然后，我们结合双液相与固定化技术，对细胞进行了培养研究。通过添加经高温灭菌后失去吸附功能的载体对细胞进行培养，研究了活性吸附载体对细胞次生代谢的刺激作用。在此基础上比较了吸附固定化双液相培养、添加无吸附性能载体的细胞双液相悬浮培养、海藻酸钙包埋固定化双液相培养等的结果。发现吸附固定化双液相培养大大提高了次生代谢物紫草宁的产率，其紫草宁终产率为O．9539／g，是普通悬浮培养的6．27倍。同时吸附固定化培养的结果优于包埋培养，紫草宁产率为

8、包埋培养的1．41倍。这反映了采用紫草细胞培养的结构模型作为理论指导对细胞进行双液相与固定化培养是合理和正确的。根据对吸附固定化双液相培养的动力学研究，在悬浮培养的结构模型研究基础上，结合在培养过程中细胞生长代谢的特征，对固定化双液相培养体系建立了以底物与有机相中产物浓度为状态变量的动力学方程。该5参数方程很好地模拟了体系的底物消耗与产物合成情况。通过对反应器的传质特性与细胞代谢特征的分析，我们选择了以流化床为细