cypj蛋白晶体结构解析及其抑制剂的筛选和鉴定

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1、复旦大学博士后学位论文CyPJ蛋白晶体结构解析及其抑制剂的筛选和鉴定姓名：赵雪梅申请学位级别：博士后专业：医学遗传学指导教师：余龙20050601博十后出站报告CyPJ蛋白晶体结构解析及兑抑制剂的筛选和鉴定摘要Cyclophilins是一类进化中高度保守广泛存在的蛋白，这一家族的蛋白都具有肽酰脯氨酰顺反异构酶活性，这种活性通常被CsA抑制。我们对cyclophilins家族的新成员CyPJ的晶体结构和CyPJ蛋白抑制剂的筛选、鉴定及其生物学活性进行了研究。1、利用CyPA的结构作为研究模型，通过分子置换法在2．6A分辨率确定了CyPJ的三维结构。CyP

2、J分子含有4个螺旋和一个由8个反平行B链形成的B圆桶。CYPJ的二级结构和三级结构类似于CyPA的二、三级结构，但CyPJ含有一个额外的二硫键和4个片段的构造明显地不同于CyPA。根据于CyPA进行序列比对，确定CyPJ的活性位点为His43和GIn52，在CyPJ结构中靠近His43和GIn52处有一个保守的水分子Wat226。2、论文的第三章，介绍了针对cyPJ的虚拟筛选工作。在此工作中，首先采用了药效团数据库搜寻以产生一个较小的分子数据库，然后再采用分子对接方法对产生的数据库进行搜寻，然后利用BIACORE分子相互作用分析仪进行验证。结果表明在筛

3、选出的cyPJ蛋白的63个候选小分子化合物中有侣个分子显示了与CyPJ具有较好的结合作用。3、采用o【一胰凝乳蛋白酶活性测定法检测CyPJ活性及CyPJ与小分子化合物相互作用后的活性。结果表明：(1)CyPJ具有脯氨酸异构酶活性，并且其活性可被CsA和ZXM-A一1所抑制，IC50分别为4．929±0．25钮M和155．692±41．59鲫M；(2)通过计算机辅助设计和BIACORE分子相互作用仪验证后筛选到的CyPJ的小分子化合物对CyPJ活性的抑制作用不同，它们的lC50值从5．815—21．32舳M不等；(3)通过PPlase活性检测后，可以证明

4、通过计算机辅助设计和BIACORE分子相互作用仪验证后筛选到的部分小分子化合物对CyPJ活性没有抑制作用，如化合物ZXM．J-3，Z×M—J一10，Z×M．J．14，ZXM-J．15，ZXM—J-17，烈M-J一18。4、实验结果表明在体外ZXM—A一1能够抑4bJSK、QGY和SK-CyPJ肿瘤细胞的增复目大学生物学博十后流动站博士后出站报告CyPJ蛋白晶体结构解析及】E抑制剂的筛选和鉴定殖，其IC50分别为40．44叩M、52．438土5．91叫M和70．571±0．76即M。关键词：亲和素J、肽酰脯氨酰顺反异构酶、三维结构、小分子数据库、分子相互

5、作用分析仪、半抑制浓度复旦大学生物学博士后流动站2博上后出站报告毋P】蛋白晶体结构解析发其抑制剂的筛选和鉴定AbstractCyclophilinscompriseahighlyabundantfamilyofproteinsthatareexpressedineveryorganismstudiedtodate．Theyhavebeenshowntoactaspeptidyl-prolylc／s-transisomerasewhoseactivitycanbeinhibitedbyCsA．AnovelmembercyclophilinJinthisf

6、amilywascloned，expressedandpurified，thestructureofCyPJprotein。theinhibitorsofGyPJprotein，andthebiologicalfunctionofthoseinhibitorswasobtainedandanalyzed．(1)Thethree-dimensionalstructureofCyP．JhasbeendeterminedbymolecularreplacementusingtheCyPAstructureasthesearchmodelandhasbeenr

7、efinedat2．6Aresolution．TheCyPJmoleculecontainsfourhelicesandoneB—barrelcomposedofeightantiparallel8-strands．TheoversecondaryandtertiarystructuresofCyPJaresimilartothoseofCyPA，butCyPJcontainsanadditionaldisulfidebridgeandfoursegmentswithconformationsthatarestrikinglydifferentfrom

8、thoseofCyPA．His43andGin52ofCyPJareexpectedtobet