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时间:2019-03-20
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1、复旦大学博士后学位论文CyPJ蛋白晶体结构解析及其抑制剂的筛选和鉴定姓名:赵雪梅申请学位级别:博士后专业:医学遗传学指导教师:余龙20050601博十后出站报告CyPJ蛋白晶体结构解析及兑抑制剂的筛选和鉴定摘要Cyclophilins是一类进化中高度保守广泛存在的蛋白,这一家族的蛋白都具有肽酰脯氨酰顺反异构酶活性,这种活性通常被CsA抑制。我们对cyclophilins家族的新成员CyPJ的晶体结构和CyPJ蛋白抑制剂的筛选、鉴定及其生物学活性进行了研究。1、利用CyPA的结构作为研究模型,通过分子置换法在2.6A分辨率确定了CyPJ的三维结构。CyP
2、J分子含有4个螺旋和一个由8个反平行B链形成的B圆桶。CYPJ的二级结构和三级结构类似于CyPA的二、三级结构,但CyPJ含有一个额外的二硫键和4个片段的构造明显地不同于CyPA。根据于CyPA进行序列比对,确定CyPJ的活性位点为His43和GIn52,在CyPJ结构中靠近His43和GIn52处有一个保守的水分子Wat226。2、论文的第三章,介绍了针对cyPJ的虚拟筛选工作。在此工作中,首先采用了药效团数据库搜寻以产生一个较小的分子数据库,然后再采用分子对接方法对产生的数据库进行搜寻,然后利用BIACORE分子相互作用分析仪进行验证。结果表明在筛
3、选出的cyPJ蛋白的63个候选小分子化合物中有侣个分子显示了与CyPJ具有较好的结合作用。3、采用o【一胰凝乳蛋白酶活性测定法检测CyPJ活性及CyPJ与小分子化合物相互作用后的活性。结果表明:(1)CyPJ具有脯氨酸异构酶活性,并且其活性可被CsA和ZXM-A一1所抑制,IC50分别为4.929±0.25钮M和155.692±41.59鲫M;(2)通过计算机辅助设计和BIACORE分子相互作用仪验证后筛选到的CyPJ的小分子化合物对CyPJ活性的抑制作用不同,它们的lC50值从5.815—21.32舳M不等;(3)通过PPlase活性检测后,可以证明
4、通过计算机辅助设计和BIACORE分子相互作用仪验证后筛选到的部分小分子化合物对CyPJ活性没有抑制作用,如化合物ZXM.J-3,Z×M—J一10,Z×M.J.14,ZXM-J.15,ZXM—J-17,烈M-J一18。4、实验结果表明在体外ZXM—A一1能够抑4bJSK、QGY和SK-CyPJ肿瘤细胞的增复目大学生物学博十后流动站博士后出站报告CyPJ蛋白晶体结构解析及】E抑制剂的筛选和鉴定殖,其IC50分别为40.44叩M、52.438土5.91叫M和70.571±0.76即M。关键词:亲和素J、肽酰脯氨酰顺反异构酶、三维结构、小分子数据库、分子相互
5、作用分析仪、半抑制浓度复旦大学生物学博士后流动站2博上后出站报告毋P】蛋白晶体结构解析发其抑制剂的筛选和鉴定AbstractCyclophilinscompriseahighlyabundantfamilyofproteinsthatareexpressedineveryorganismstudiedtodate.Theyhavebeenshowntoactaspeptidyl-prolylc/s-transisomerasewhoseactivitycanbeinhibitedbyCsA.AnovelmembercyclophilinJinthisf
6、amilywascloned,expressedandpurified,thestructureofCyPJprotein。theinhibitorsofGyPJprotein,andthebiologicalfunctionofthoseinhibitorswasobtainedandanalyzed.(1)Thethree-dimensionalstructureofCyP.JhasbeendeterminedbymolecularreplacementusingtheCyPAstructureasthesearchmodelandhasbeenr
7、efinedat2.6Aresolution.TheCyPJmoleculecontainsfourhelicesandoneB—barrelcomposedofeightantiparallel8-strands.TheoversecondaryandtertiarystructuresofCyPJaresimilartothoseofCyPA,butCyPJcontainsanadditionaldisulfidebridgeandfoursegmentswithconformationsthatarestrikinglydifferentfrom
8、thoseofCyPA.His43andGin52ofCyPJareexpectedtobet
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