试析重组工程在运动发酵单胞菌中的应用研究

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1、天津大学硕士学位论文重组工程在运动发酵单胞菌中的应用研究姓名：张宜建申请学位级别：硕士专业：化学工艺指导教师：张敏华20070101中文摘要重组工程(recombineering)是近几年来兴起的一种新型的遗传工程技术，可有效促进线形DNA分子之间和线形DNA分子与染色体、质粒之间的重组，从而成为在大肠杆菌中进行基因操作及基因组学研究的最有力的新工具之一，它同时也在其它少数几种细菌中得到初步应用。运动发酵单胞菌有着非常独特的生物学特性，并能高效发酵产醇，被认为是极具开发潜力的乙醇生产菌，人们对它已经做了大量工作。但高效、简单、快速的遗传操作手段的缺乏，限制了人们对

2、它的生物学特性的进一步认识和遗传改造。若能将重组工程技术应用于运动发酵单胞菌，必将大大加速对它的研究。本研究首次将基于red基因的重组系统引入运动发酵单胞茵，并进行了初步的重组应用。首先将在大肠杆菌中得到广泛应用的、携带^重组red基因的质粒pKD46(araC，Para-red，pSCl01ori，amp)，直接引入运动发酵单胞菌，得到ZM4(pKD46)，并通过抗性检查、PCR鉴定、酶切分析等手段，初步证明pKD46能在ZM4中复制和存在：进一步以穿梭载体pZB21(E．coliori，Z．mobilisori，amp，cml，tet)和pKD46为出发材料，

3、构建得至llpZB21．red(E．coliori，z．mobilisori，tet，araC，Para．red)，并转化到ZM4中，得到ZM4(pZB21．red)；然后通过PCR方式制备含同源臂(左、右各79bp)和氯霉素抗性基因(cml)的打靶片段，参照带pK．D46的大肠杆菌菌株中的打靶条件，分别对ZM4(pKD46)、ZM4(pZB21-red)进行打靶实验，经PCR鉴定，)AZM4(pZB21．red)顺利得到ZM4染色体上乳酸脱氢酶基因(1dh)缺失而被cm，基因取代的重组子，且此重组子很容易通过无抗性压力条件下的连续转接培养而去掉pZB21．red

4、；从ZM4(pKD46)则没有得到任何目的重组子。本研究初步证明重组工程可以用于运动发酵单胞菌，为下一步优化重组系统各要素、提高重组效率奠定了很好的工作基础。关键词：重组工程运动发酵单胞菌打靶ABSTRACTRecombineeringisanewgeneticengineeringbioteclmologythathasrecentlybeendeveloped．ItCallefficientlyboosttherecombinationbetweenlinearDNAmoleculeandlinearDNAmolecule，linearDNAmolecules

5、andchromosomeorplasmidDNA．ItisoneofthemostforcefulnewimplementingenemanipulationandgenomicsresearchinE．coli，ithasalsobeenusedforseveralotherkindsofbacteria．ZymomonasmobilishasuniquebiologycharacteristicsandCanhi曲lyeffectivelyfermentsugarstOalcoh01．Itisconsideredasapotentialalcoholprod

6、ucerandhasbeenresearchedwidely．Butthelackofhi曲lyeffective，simpleandspeedygeneticmanipulationmethodhasembarrassedresearcherforfurtherstudyingitsbiologycharacteristics，andgeneticmanipulationusingrecombineeringinZ．mobiliswillgreatlyaccelerateresearchforit．Thisstudyisthefirstattempttointr

7、oducerecombineeringsystemintoZmobilisanduseitforrecombination．Firstly,plasmidpKD46(araC，Para-red，pSCl01ori，amp)，beingwidelyusedinE．colirecombineering，WasdirectlyintroducedintoZmobilis，resultinginstrainZM4(pKD46)，andwasinitiallyprovedtoduplicateandexistinZM4byantibioticresistancecheck,

8、PCRid