试析微生物转化法合成天麻素等天然活性成分的研究

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1、分类号——密级单位代码!鱼!!!学号20031104西北大学博士学位论文题目丝生堑盐垡溘金盛苤座盍釜墨丛鲨：建成分的研究作者盎塞煎指导教师一塞丝蓥专业技术职称教授学科(专业)垡堂墨堡答辩日期2007．6学位授予日期二00七年五月摘要本论文旨在利用微生物转化法对底物结构进行修饰，从而生物合成天麻素及红景天苷。通过对转化菌株的诱变选育，同时兼顾转化条件的优化，为天麻素及红景天苷的合成提供一条行之有效的新途径。在此基础上，对相关糖基化酶进行分离纯化及性质研究，为以后其它天然产物的糖基化反应提供新的思路和方法。采用静息细胞法和分批培养法，结合ⅡC和HPLC从数十株霉菌、酵母菌

2、、细菌中筛选到了能够将对羟基苯甲醛转化成天麻素的根霉LN．1和一株能将对羟基苯乙醇转化为红景天苷的假单胞菌Z-1。分别对12q．1及Z-1转化条件进行了优化，结果表明根霉LN．1转化合成天麻素的最适条件为：129(湿重)静息细胞／120mL转化液，底物质量浓度2．3mg／mL，pH5．5，28"C转化24h，天麻素得率可达16％。7．-1转化合成红景天苷的最适条件为：以葡萄糖作为碳源。酵母膏或硫酸铵作为氮源，底物浓度为L5mg／mL，pH7．0，33℃转化20h，红景天苷的得率可达10％。进一步开展放大试验，转化液经萃取、硅胶柱色谱分离等得到转化产物，经HPLC、NM

3、R、E1．MS等的测定，证明所得转化产物为天麻素及红景天苷。同时，利用紫外、He-He激光复合诱变LN．1的孢子及原生质体，获得了转化率及天麻素得率均明显提高的突变株．采用硫酸铵沉淀、DEADCellulose52离子交换层析及SepharoseCL-6B凝胶柱层析等一系列纯化步骤获得了电泳纯的天麻素合成酶，并用SDS．PAGE的方法测定其分子量为63．2kDa。样品酶的比活力为174．2U／mg，纯化倍数为323，回收率为11．4％．通过分析该酶的性质，得出最适温度为50℃，在50℃以下基本保持稳定；最适pH6．0，在pH6．0．9．0的范围内基本稳定。微生物作为生

4、物转化体系中一个重要组成部分，对研究天然活性成分的合成有着不可替代的作用。本研究利用微生物转化法合成了天麻素及红景天苷，摸索出了一条生产天麻索及红景天苷的新途径，具有广阔的应用前景。关键词：微生物转化；天麻素；红景天苷；静息细胞：诱变StudiesonBiosynthesisofGastrodinandOtherBioactiveNaturalProductsbymicrobialtransformationAbstractGastrodinandsalidroside，themajoringredientofthewell-knownChinesemedicine,

5、werebiosynthesizedthroughmicrobialtransformation．whichisanewmethoddifferentfromchemicalsynthesisandtraditionalplantextraction．Inthisexperiment,mutagcuesisofthestrain’optimazitionoftransformingcondition，extractionandpurificationofthetHlzymcwerediscussedinordertofindthemoreefficientandeco

6、nomicalmethodforgastrodinandsalidrosidesynthesisandofferanewchannelformicrobialtransformationofotherbioactivenaturalproducts．Usingthemethodofbatchcultureandrestingculture,Rh／zop淞LN-1andpseudomonasZ-1，whichhavetheabilitytobiosynthesizegastrodinandsalidrosideweresreenedsequentlyfrommanyfu

7、ngi，yeastandbacteriaaccordingtotheirTLCandHPLCresults．Theoptimaltransformingconditionwasinvestigated：129restingcell(wetweigh0incubatedat28"Cfor24hours．ina500raLflaskcontainin9120mLofmedium,producedagoodyieldofgastredin(16％)byadding2．3mg／mLsubstrate(finalconcentration)．Theoptima