托克逊县部分地区牛环形泰勒虫病的流行病学调查

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托克逊县部分地区牛环形泰勒虫病的流行病学调查摘要牛环形泰勒虫病是由携带该病原的蜱叮咬和感染牛所致的一种原虫病。该病以高热、消瘦、贫血和周身淋巴结肿胀为特征，常引起牛致死性白细胞增殖紊乱。国际兽医局（OIE）把该病定为必须通报的重大动物疾病。牛环形泰勒虫的传播媒介为璃眼蜱属，在新疆分布较广，所携带的病原感染牛导致泰氏焦虫病常见、多发，严重危害养牛业的可持续发展，是重点防控的寄生虫病。因此，为了更好地对吐鲁番托克逊县部分地区牛环形泰勒虫病实施防控，本研究调查了解牛环形泰勒虫病及其传播媒介蜱的地方性流行规律，阐明环形泰勒虫病在当地的流行现状。本文对随机采自托克逊县夏乡南湖村的蜱虫和牛全血进行试验，通过显微镜蜱种鉴定发现该地牛环形泰勒虫的传播媒介蜱为小亚璃眼蜱。通过血液涂片检查，共104份血液样品中有53份发现了圆点状或戒指状的虫体，根据环形泰勒虫的病原形态可确诊这些虫体为牛环形泰勒虫，即阳性率为51.0%。统计不同年龄段牛只环形泰勒虫血涂片的感染情况，结果显示0～6月龄的牛对环形泰勒虫的感染率最高，为71.4%，与吐鲁番地区相关报道结果（1～3岁）不一致；分别计算各年龄段牛红细胞染虫率，发现带虫率不超过5%。统计18家养牛户血涂片的感染情况，发现有2家养牛户感染率为100%，有3家养牛户感染率为0，有10家养牛户的感染率不小于50%。本试验基本查清了目前牛环形泰勒虫在托克逊县夏乡南湖村的流行情况，可为当地牛环形泰勒虫病的综合防治提供参考资料。本试验参考ChristineD’Oliveira中已发表的牛环形泰勒虫Tams1基因序列，合成一对特异性引物，提取环形泰勒虫病原DNA，对吐鲁番托克逊县随机104头份牛的全血进行了PCR检测，并在特异性和灵敏度方面与血液涂片方法进行对比检测。结果表明，PCR方法检出率（57.7%）高于血涂片的检出率（51.0%）。对不同年龄段牛的感染情况，PCR结果显示1～2岁的牛对环形泰勒虫的感染率最高，为72.7%，与吐鲁番地区相关报道结果（1～3岁）基本一致。各养牛户PCR方法检测感染率（56.1%）高于涂片染色镜检的感染率（48.1%），说明PCR检测方法较血涂片方法特异性强，灵敏度高。PCR诊断方法的建立为托克逊县夏乡南湖村牛泰式焦虫病的早期诊断提供了技术支撑，试验参数更准确地显示了该地牛环形泰勒虫的感染现状，为我区的牛环形泰勒虫病提供了防治依据。关键词：环形泰勒虫；流行病学调查；媒介蜱；感染率I EpidemiologicalInvestigationTheileriaannulataforCattleinpartsofToksunCountryAbstractTheileriaannulataforcattleisaprotozoandiseasewhichcarryingthepathogeninfectioncausedbythetickbites.Thediseaseischaracterizedbyhighfever,anemia,hemorrhage,emaciationandsuperficiallymphnodeswelling,oftenmakewhitebloodcellsproliferatearedisordereddeadlyincattle.OfficeInternationalDesEpizooties(OIE)willbelistedastheanimaldiseasemustinformed.Theileriaannulataforcattle’smediaisHyalomma,whichwidelydistributedinXinjiang,causedbyTai’sbabesiosisincommonandmultiple,andseriouslyharmtothesustainabledevelopmentforindustrycattle,isanparasiticdiseaseemphasisonpreventandcontrol.Therefore,inordertobegoodforpartsoftheTurpanringareaToksunCountycattleTaylordiseaseinvestigationtounderstandtheimplementationofpreventionandcontrol,thispapergavearegularityofTheileriaannulataandTaylormediatick,clarifytheepidemicsituationofTaylordieaseinzhelocalring.ThispaperwascarriedoutsomeexperimentsonrandomlycollectedfromLakeVillageSummerToksunCountytownshipsometickswhichthroughthemicroscopeandcattleblood,foundthatthecattletickspeciesidentificationTheileriaannulatamediatickisHyalommaanatolicumanatolicum.Throughthebloodsmearexamination,atotalof104bloodsamplesin53founddotlikeorringshapedbody,accordingtoTheileriaannulatapathogenmorphologycanbediagnosedthesewormsisTheileriaannulataforcattlenamely,thepositiveratewas51%.TheinfectionofdifferentagesandstatisticsTheileriaannulatainsectbloodsmear,resultsshowedthat0~6ageofcattleonaTheileriaannulatahadthehighestinfectionrateofinsects,71.4%,andTurpanreportedinconsistentresults(1～3yearsold);theageofbovineredbloodcellinfectionrateswerecalculated,foundthattheparasitecarryingrateofnotmorethan5%.Theinfectionstatisticsof18cattlefarmsbloodsmear,foundout2cattlefarmsinfectionratewas100%,therewere3cattlefarmsinfectionratewas0,therewere10cattlefarmsinfectionrateofnotlessthan50%.ThisexperimentistofindouttheepidemicsituationofTheileriaannulataforcattleinNanHuVillageSummerToksunCountyTownship,andcanprovidesomereferenceforthecomprehensivepreventionandcontrolofthediseasewhenTheileriaannulataforcattle.TheileriaannulataforcattleTams1genesequencepublishedinChristineDinOliveira,apairofspecificprimerstoextracttheTheileriaannulatainsectpathogenDNAofTurpanToksunCounty,104randomsamplesofcattleheadbloodweredetectedbyPCR,andcomparedwithbloodsmearmethodintheareawiththesensitivityandspecificityofdetection.TheresultsshowedthatthedetectionratesofPCR(57.7%)washigherthanthatofbloodsmear(51%).Thedifferentagesofinfectionincattle,PCRresultsshowedthat1~2yearsoldcattleTheileriaannulataisthehighestinfectionratewas72.7%,andtheTurpanareareportedresults(1～3yearsold).ThecattlemenPCRmethodtodetecttheinfectionrate(56.1%)higherthanthesmearstainingrateofinfection(48.1%),PCRtestmethodisbloodsmearmethodwithstrongspecificity,highsensitivity.PCRmethodwhichisestablishedfortheearlydiagnosisofToksunCountyXiaXiangNanHuVillageTheileriaannulatawasprovidedtechnicalsupportforcattle;thetestparametersmoreaccuratelyshowedthattheinfectionstatusofTheileriaannulatapiroplasmosis,providethebasisforpreventionofTheileriaannulatainourdistrictforcattle.Keywords：Theileriaannulata;epidemiologicalinvestigation;mediumtick;infectionrateII 目录第1章牛环形泰勒虫病的研究进展..................................................................11.1病原学...........................................................................................................................11.2流行病学.......................................................................................................................31.3临床症状和病理变化...................................................................................................51.4牛环形泰勒虫病的诊断方法.......................................................................................61.5牛环形泰勒虫病的防治.............................................................................................111.6本研究的目的和意义.................................................................................................12第2章托克逊县夏乡南湖村牛环形泰勒虫病的调查情况...........................132.1试验材料.....................................................................................................................132.2试验方法.....................................................................................................................142.3试验结果.....................................................................................................................152.4讨论.............................................................................................................................18第3章两种检测方法诊断牛环形泰勒虫病的比较.......................................203.1试验材料.....................................................................................................................203.2试验方法.....................................................................................................................213.3试验结果.....................................................................................................................223.4小结.............................................................................................................................25全文结论..............................................................................................................27参考文献..............................................................................................................28附录.......................................................................................................................34致谢.......................................................................................................................37作者简历..............................................................................................................38III 英文缩略词表缩略语英文全称中文全称bpBasepair碱基对DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPDeoxynucleosidetriphosphate脱氧核糖三磷酸EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸gGram克hHour小时hm²Squarehectometer公顷LLiter升mgMilligram毫克minMinute分钟mLMilliliter毫升mol/LMole/liter摩尔/升OIEOfficeInternationalDesEpizooties国际兽疫局PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应pHPotentialOfHydrogen酸碱度rpmOtatepermin每分钟转数sSecond秒TAETris/acetate/EDTAbufferTris/乙酸/EDTA缓冲液TaqThermusaquaticusDNAPolyermase栖热水生菌DNA聚合酶TrisTris-hydroxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷μLMicroliter微升IV 新疆农业大学硕士学位论文第1章牛环形泰勒虫病的研究进展泰勒虫病是由蜱传原虫引起的一种梨形虫病，而泰勒虫和巴贝斯虫是牛的主要感染源，其中环形泰勒虫对我国的牛危害最大。牛环形泰勒虫病是由携带该病原的蜱叮咬和感染牛所致的一种原虫病[1]。该病以高热、贫血、消瘦和周身淋巴结肿胀为特征，常引起牛致死性白细胞增殖紊乱[2]。国际兽疫局（OfficeInternationalDesEpizooties，OIE）将该病定为必须通报的动物疫病。该病具有很强的季节性和地方流行性，新引进牛和纯种牛比本地牛更敏感，血液涂片镜检的染虫率只有2%～3%就会发病[3-4]，且病症情况严重，病牛死亡趋势很快。该病在世界范围内也有着广泛的分布，主要集中在亚洲、欧洲南部和北非。在我国，该病对东北、西北和华北地区，如黑龙江、宁夏、河北等很多省区也造成了不可估量的损失，新疆更是该病的主要大流行地之一，感染率甚至达80%以上，已成为严重威胁我国养牛业的重大疾病，是很多地区发展畜牧业的限制性要素。1.1病原学1.1.1病原形态1897年柯赫在非洲首次发现了存在于牛体内的泰勒虫，继而1904年由泰勒在俄国动物红细胞中发现，当时一直未确定泰勒虫和巴贝斯虫的形态区别。1907年，贝坦科尔等进行分类，梨形虫属和泰勒属正式确立[5]。牛环形泰勒虫主要存在于红细胞和淋巴细胞内，称为配子体或血液型虫体。虫体小于细胞半径，单个红细胞内存在的虫体数为1～12个左右，多数为2～3个，这与虫体的感染强度有关。虫体形状多样，有圆环状、圆点状、椭圆状、戒指状、逗点状、杆状、十字状等多种形状。其中以圆环状和戒指状为主，占所有形状虫体的70%～80%，其它形态的比例很小，大约5%左右，各种形态的虫体可同时出现在同一个红细胞内。用姬姆萨染色镜检，虫体胞浆淡蓝色核紫红色[6]。环形泰勒虫子孢子进入红细胞之前在单核巨噬系统的细胞内寄生，然后裂体增殖变成多核虫体，称为石榴体，又称柯赫氏蓝体（Koch’sbluebodies）。平均大小有8µm，有的可达到15µm～27µm。虫体呈圆形、卵圆形或者蚕豆形，位于淋巴细胞或单核细1 托克逊县部分地区牛环形泰勒虫病的流行病学调查胞的胞浆内或游离于细胞外，用姬氏染色，淡蓝色的虫体胞浆内含许多紫红色颗粒状的核[7-8]。1.1.2生活史环形泰勒虫的发育过程包括裂体生殖、配子生殖、孢子生殖三个复杂的阶段（如图1-1所示）。裂体生殖：牛感染蜱后，蜱吸血时产生的唾液将子孢子带入牛体内，首先侵入脾、淋巴结、肝等网状内皮系统，寄生淋巴细胞内，发育为大裂殖体。大裂殖体成熟破裂释放出大裂殖子，这些大裂殖子又侵入别的淋巴细胞进行重复性的无性型繁殖。配子生殖：有的大裂殖子到一定阶段会发育成有性繁殖的小裂殖体，同样小裂殖体形成的小裂殖子侵入红细胞内发育成各种形态的虫体，即配子体。孢子生殖：配子体随着蜱在病牛身上吸血进入蜱体内后经历合子、动合子、合孢子的发育阶段，最后形成许多具有传播性的子孢子。在蜱寄生后，新的一轮子孢子又会出生，牛体内的生活史便这样不断重复上演[9]。图1-1环形泰勒虫的生活史阶段[10]Fig.1-1LifecyclestagesofTheileriaannulata2 新疆农业大学硕士学位论文1.2流行病学1.2.1牛环形泰勒虫病的一般流行规律璃眼蜱属的蜱类作为牛环形泰勒虫病的主要传播媒介，目前已发现的蜱种有残缘璃眼蜱、小亚璃眼蜱、盾糙璃眼蜱、边缘璃眼蜱和嗜驼璃眼蜱等。在我国，残缘璃眼蜱（Hyalommadetritum）和小亚璃眼蜱（Hyalommaanatoricum）均可传播该病。小亚璃眼蜱是新疆南部地区的媒介蜱。残缘璃眼蜱为二宿主圈舍蜱，是牛环形泰勒虫病的主要传播者。本病的感染与蜱的活动都具有很规律的季节性。雌虫在牛圈内产卵后，每年5月左右成蜱出现，即4月下旬或5月初发病开始，病畜数量较少。随着天气逐渐升温，7月最多，病畜发病达到高潮。之后开始下降，8月中旬到9月上旬几乎停止发病。由此可见本病季节性的流行动态是随着环形泰勒虫侵袭牛体的消长而变化，二者变化规律几乎一致。另外，本病的传播与病情的轻重与牛的品种、来源和年龄都有关系。从外地引进的牛很容易感染环形泰勒虫，而且发病症状很严重，致死率比当地土生土长的牛高很多[11]。据统计，本病多发于1～3岁的牛，患过本病后成为带虫者，对本病的抵抗力增强，这种带虫免疫一般可达三年到六年的免疫时间。1.2.2牛环形泰勒虫病的国内外流行情况在国外，环形泰勒虫病对养牛业的威胁遍布到北非、南欧、中东、中亚及印度次大陆地区的各个国家[12]。本虫分布于非洲的阿尔及利亚、埃及、利比亚、摩洛哥、苏丹、突尼斯、伊拉克、伊朗、以色列、土耳其、巴基斯坦、印度、保加利亚、塞浦路斯、希腊、意大利、罗马尼亚等地区[13]。在我国，最早于1960年通过试验证明了环形泰勒虫病的传播媒介为残缘璃眼蜱[14]，之后陆续在内蒙、新疆、甘肃、宁夏、河南、河北、湖北等14个省（区）均出现牛环形泰勒虫病的报道，疫区内的发病率为34.07%（17.8%～50%），致死率为43.64%（16.6%～60%）[15-16]。据近几年的报道，2012年于吉林省南部山区发生该病，致死率为16.7%[17]。2013年于黑龙江省哈尔滨市某大型养殖场黄牛的发病率为5.83%，致死率为22.9%，奶牛发病率为6%，致死率为16.7%[18]。3 托克逊县部分地区牛环形泰勒虫病的流行病学调查在新疆，牛环形泰勒虫病及媒介蜱已成为每年常见、多发、重点防控的重要寄生虫病。据文献记载，新疆寄生蜱的数量占全国的2/3之多，对新疆畜牧业的健康发展造成了不可估量的经济损失。该病在乌鲁木齐、乌苏、托克逊、吐鲁番、塔城、克拉玛依、阜康、和静、奇台、昌吉、玛纳斯、精河、伊宁、呼图壁、阿克苏等地、州和县均有不同程度地流行，有些地区的养殖牧区的发病率高达35%～60%，致死率高达46.4%[19]。据近几年的报道，2006年克拉玛依市某牧场引入的荷斯坦奶牛感染环形泰勒虫，发病率达30%[20]，2009年乌尔禾乡的发病率为20%，致死率为4.5%，尤其是该区的良种牛发病率高达40%[21]；2007年石河子地区爆发牛环形泰勒虫病，感染严重，发病率为8%～15%，致死率为20%～30%，发现其中年龄在1～3岁的牛占多数，占发病总数的2/3左右，初生的犊牛和成年牛也有散发[22]；2008年阿勒泰地区福海县阔可阿尕什乡的感染率不减反增，最初的发病的良种奶牛只有49头，而且病情较轻，最后增长到127头，大多数预后不良，致死率为18%～34%[23]；；2012年喀什地区阿合奇县色乡牦牛环形泰勒虫病感染率为33.33%，其主要传播媒介是小亚璃眼蜱和亚洲璃眼蜱[24]。另外，新疆南疆地区一些散养户牛场的感染情况同样不容乐观：牛环形泰勒虫感染率最为严重，高达71.4%，同时其它梨形虫，如双芽巴贝斯虫感染率为40.5%，牛巴贝斯虫感染率为29%，几种梨形虫交叉感染情况时有发生；其主要传播蜱是残缘璃眼蜱、小亚璃眼蜱和微小牛蜱[25]；在吐鲁番地区，自2004年5月在托克逊县夏乡首次发现牛焦虫病[26]，之后该病在托克逊县开始向四周蔓延。2004年托克逊县依拉湖乡爆发该病，牛群全部被感染，发病率为100%，致死率为63%[27]；2007年至2011年间，托克逊县夏乡发病率为13.61%，致死率为22.45%；托克逊县依拉湖乡发病率为9.77%，致死率为24.81%；托克逊县托克逊镇发病率为8.07%，致死率为18.06%；托克逊县郭勒布依乡发病率为9.08%，致死率为33.33%；托克逊县库米什镇和克尔碱镇并没有检测到该病[26]43。吐鲁番市和鄯善县部分地区的发病率和死亡率同样居高不下。4 新疆农业大学硕士学位论文1.3临床症状与病理变化1.3.1临床症状牛环形泰勒虫病的最短潜伏期为14d，最长潜伏期为20d。这时牛只并不表现临床症状。用蜱进行人工感染时，常见潜伏期为10d。发病期又分为前中后期。刚发病时牛只精神、食欲变差，结膜潮红，心跳加速，呼吸急促，病畜体表淋巴结硬肿有痛感，体温升至39℃～41.8℃，高热稽留达4d～10d，少数病牛呈弛张热或间歇热。这时镜检会发现红细胞和淋巴细胞均已被感染。某些重症病例有时出现这些初期症状一周左右，由于一些主要器官的功能障碍造成机体严重紊乱和周身物质代谢严重瘫痪而死亡[28]。中期病牛食欲几近废绝，迅速消瘦，行走无力，反应迟缓。病畜呻吟，排干而黑的粪便，便秘与腹泻交替出现，粪便常带有粘液或血丝，尿黄而频，体温再一次高至40℃～42℃，眼结膜充血肿胀，眼鼻流分泌物，心音亢进有杂音，脆弱而快。病情恶化到后期，病畜卧地不起，反刍停止，病重者可视黏膜及尾根、肛门周围、阴囊、乳房等部位的娇嫩处上会出现大至扁豆，小至粟粒的深红色溢血斑点，这是濒于死亡的征兆[29]。目前，只要合理用药，治疗及时，护理得当，病牛可逐渐恢复健康，大大降低患畜的死亡率。有些耐过的牛成为带虫者。1.3.2病理变化尸体僵直，极度消瘦，周身皮下脂肪、肌肉、器官粘膜上均可见密密麻麻的点状出血和血斑[30-31]。肩前淋巴结和腹股沟淋巴结等浅表淋巴结明显肿大，呈紫红色，从硬变软，切开多汁，切面可见大小不一的灰白色结节。脾脏、肝脏、肾脏、胆囊等各脏器及相关淋巴结均有不同程度的肿大和黄染，被膜上有散布的出血点，肺脏水肿和气肿。皱胃黏膜肿胀，可见大小不等的出血斑和针尖般的暗红色或黄白色结节，结节部位出现中央凹陷呈灰色，边缘隆起呈红色或红褐色溃疡灶，溃疡大小不一，有针尖大至高粱米大，周围黏膜充血形成暗红色淤血条带。有些严重的病例，这种病变程度可覆盖皱胃全部粘膜的一半以上[32]，皱胃的上述变化眼观明显，症状突出，十分具有诊断意义。5 托克逊县部分地区牛环形泰勒虫病的流行病学调查1.4牛环形泰勒虫病的诊断方法1.4.1病原学诊断牛环形泰勒虫病的病原学诊断主要是血液涂片染色镜检法和淋巴结穿刺检查法。自从1904年Dschunkowsky和Luhs在俄国用血涂片染色镜检法首次发现了泰勒虫[33]，时至今日，该方法仍然被广泛使用，尤其是在流行病学方面许多相关部门十分依赖血涂片染色镜检，是当下利用最为普遍的检测手段。这种方法最大的优点就是操作简单，只需从牛只身上采取少量血液进行抹片，之后使用甲醇固定，再用姬姆萨染液染色一段时间。时间到了以后蒸馏水冲洗干净，晾干后便可在油镜下寻找红细胞内的特征性虫体，再结合临床症状和当地的流行病学资料，便可得出较为可靠的诊断结果。呈急性经过症状的病畜使用血涂片染色镜检具有很好的检出率，但是如果红细胞带虫率不高或者病例感染初期呈隐性感染，在这种情况下是很难观察到虫体的感染情况，容易出现漏检；同时由于染料浓度、染色时间、制片的质量、观片的经验等因素的存在，都会直接影响检测结果的准确性[34]。1906年，Koch发现了淋巴细胞内泰勒虫的裂殖体发育阶段，并命名淋巴细胞内的裂殖体为“柯赫氏蓝体”，从此淋巴结穿刺便作为一种诊断方法被广为使用。该方法与血涂片染色镜检法较为相似，检查时，选择体表肿大的淋巴结用无菌注射器进行穿刺，抽取部分淋巴内容物，涂片固定，染色镜检，在淋巴细胞内观察到裂殖体即可[35]。但由于裂殖体出现阳性的时间很短[36]，不能作为确诊的主要方法，只能用于辅助诊断。另外，许多兽医也常通过牛体表淋巴结，尤其是肩前或腹股沟淋巴结肿大进行临床初步诊断。1.4.2血清学诊断血清学诊断是用已知抗原检测机体中是否有相应抗体的方法。由于特异性和灵敏度强，血清学方法的使用比较广泛，迄今为止，全世界范围已发明的血清学检测方法有：间接荧光抗体试验（IndirectImmunofluorescentAntibodyTest,IFAT）、酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA）、补体结合试验(ComplementFixationTest,CFT)。6 新疆农业大学硕士学位论文1.4.2.1间接荧光抗体试验（IFAT）间接荧光抗体试验（IFAT）是将荧光抗体加入抗原抗体复合物，形成免疫荧光复合物，通过在显微镜下观察荧光信号进行判定的方法。1969年Pipano等人用被人为感染环形泰勒虫的牛的肝脏，制作出可检测治愈牛和免疫牛的抗体水平的IFAT玻片抗原，抗体滴度可达1:1000[37]。d'Oliveira等人在1995年运用IFAT对西班牙地区92份牛血清进行环形泰勒虫的检测，结果血清感染率为40%[38]。1996年Darghouth等人再一次用IFAT随机对突尼斯西迪地区51个牛场进行了检测，结果有47个农场的牛血清发现了环形泰勒虫抗体，感染率为92%[39]。Gray研究表明，动物发生虫体感染后，IFAT可以在很短的时间内发现体内抗体，并且只需要少量抗原就可以检测，很好的保护了抗原表位的完整性，这样该方法就更加敏感特异[40]。IFAT由于敏感、快速，稳定，常常用于环形泰勒虫的诊断，可以现场诊断而且结果直观。但它的不足同样存在，这种方法操作复杂，通过镜检对结果的判定具有主观臆断性，非特异性荧光更会造成假阳性结果，而且一般的实验室并没有配备荧光显微镜，无法进行广泛应用[41]。1.4.2.2酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA是以酶作为标识，在固相载体表面使抗原抗体反应的技术。因为快速灵敏，稳定特异，检测量大，载体易于标准化，操作简便等优点，已经成为目前应用最多最广的检测方法。1972年，Engvall等人首次建立ELISA方法，之后人们不断的进行优化完善，间接法、双抗体夹心法、阻断法、竞争法等多种ELISA方法的诞生为很多疾病的诊断做出了巨大贡献，如今这些方法已被广泛应用于寄生虫诊断等各个领域[42]。1980年Gray等人首次用梨形虫抗原进行ELISA试验用于环形泰勒虫感染的诊断[43]，1985年欧永春等人将裂殖体作为抗原用于ELISA试验[44]，都取得明显的效果。1989年Innes等人在进行ELISA检测方法之前，试验了抗原优化选择，证明红细胞虫体是ELISA的最佳抗原[45]。1992年Kachani等人也证明了这点[46]。基因重组抗原的建立取代了虫体纯化抗原，环形泰勒虫ELISA诊断抗原迎来了基因重组抗原时代[47-49]。其中，裂殖体表面抗原ELISA（TaSP-ELISA）和裂殖子表面抗原ELISA（Tams1-ELISA）比较成熟，国内外对此做了大量的研究。2002年Schnittger等人首次利用TaSP的环形泰勒虫膜内蛋白进行牛环形泰勒虫病7 托克逊县部分地区牛环形泰勒虫病的流行病学调查的检测。2004年，Bakheit等人学习Schnittger，用TaSP重组抗原对苏丹地区140头牛的血清进行检测，120份血清出现阳性，感染率85.7%，与IFAT试验结果比较发现其灵敏度和特异性分别为99.1%和90.47%[50]，说明TaSP-ELISA对环形泰勒虫病的流行资料调查具有良好的效果。2007年Salih等人用TaSP-ELISA、显微镜镜检、IFAT法分别对苏丹北部地区环形泰勒虫病的流行情况进行了对比检测，结果显微镜镜检感染率为13.7%，IFAT检出率为35.7%，TaSP-ELISA感染率为30%，以IFAT结果对比，灵敏度和特异性分别为70.7%和81.8%[51-53]。通过对比可发现Tasp-ELISA在检测特异性环形泰勒虫抗体方面具有很大的应用前景[57]。1997年d'Oliveira等人发现裂殖子上的环形泰勒虫膜内蛋白有Tams-1和Tams-2两种形式等位基因[58]。Gubbels等人首先用基于Tams-1和Tams-2的4种重组蛋白作为抗原，通过优化包被浓度、洗涤步骤、二抗类型等条件，建立了重组Tams1间接ELISA方法，试验结果表明重组Tams1间接ELISA是潜在的能用于环形泰勒虫病流行病学调查的工具[59]。国内，黄家雨和简子健等对环形泰勒虫新疆分离株Tams1全长基因进行了克隆与表达，并用建立的间接ELISA方法调查了全疆14个地州共1390头牛该病的感染状况，发现各地州均有分布，阳性率为11.42%[61-62]。1.4.2.3补体结合试验（CFT）补体结合试验是将抗原抗体复合物与补体结合，消耗补体反应液中的补体，使原有浓度降低以检出抗原和抗体的试验。尽管操作细致复杂，但具有高敏感性和适应性广等优点，仍然被有效应用。1965年，Shindler等人使用补体结合试验检测环形泰勒虫的感染情况[63]。1967年Konyukhov等人用病牛红细胞内的环形泰勒虫虫体作为抗原，用补体结合试验检测出发病牛和治愈牛血清中的抗体[64]。1996年殷宏等人成功地建立了对环形泰勒虫感染的补体结合试验诊断方法[65]。2008年Butler等人将CFT、PCR、IFAT三种检测方法进行比较，证明在隐性感染和带虫免疫的情况下，CFT比其它两种对检测方法更有优势，敏感性更高[66]。但CFT的高敏感性在治疗的过程中会不断降低，一些血清会产生补体反应，而且特异性抗原来源有限，影响因素较多，实验难以标准化，ELISA方法正逐步取代CFT。8 新疆农业大学硕士学位论文1.4.3分子生物学诊断分子生物学诊断技术是新兴起来的一种特殊检测技术，被称为基因核酸诊断技术，是现代分子生物学和分子遗传学发展的产物，具有高度的特异性强和敏感性。主要包括聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）、反向线性杂交技术（ReverseLineBlotassay,RLB）、环介导等温扩增反应（Loop-MediatedIsothermalAmplification,LAMP）等。1.4.3.1聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（PCR）是通过一对特异性引物结合特异性靶基因进行体外DNA扩增的技术[67-68]。DNA在体外高温（95℃）的情况下变性成单链，低温（55℃左右）时将引物与单链按碱基互补配对结合，再将温度调至DNA聚合酶最适反应温度（72℃），DNA聚合酶会沿着磷酸到五碳糖的方向合成互补链。1985年美国人Mullis发明该项技术，为基因研究和生命科学的快速发展产生了深远的影响，也是目前最具应用前景的检测技术。同时，PCR技术由于在病原检测方面具有很高的特异性和敏感性，在国外PCR技术早已建立了牛环形泰勒虫、巴贝斯虫、中央无浆体的诊断并广泛应用[69]。1992年Bishop等人首次用PCR技术诊断泰勒虫病[70]。1995年d’Oliveira使用环形泰勒虫30kDa（Tams1）蛋白编码基因序列设计了特异性引物，发现只有环形泰勒虫可以进行DNA扩增，成功建立了环形泰勒虫病的PCR诊断方法，而且敏感性良好，1ul牛血样中就会发现有1个虫体[71]，2000年Kirvar等人通过试验也证明了这点[72]。2000年Roy等人另辟蹊径，通过扩增环形泰勒虫的小RNA基因对50头已知的带虫免疫的牛进行检测，结果显示42头呈阳性血；再用血涂片镜检对这42头检测，结果只有8头为阳性，这种扩增特殊靶基因的敏感性可达0.00008%[73]。在后续的发展中，PCR技术逐渐衍生出了多种特异性检测技术，如巢式PCR、半巢式PCR、荧光定量PCR等多项技术，这些技术现已在环形泰勒虫方面做出了许多重大的突破。Martin等人、Vatansever等人分别于1999年、2002年建立了环形泰勒虫病的巢式PCR诊断方法，后者对土耳其的147份健康牛血样进行检测，阳性率为61.2%，高于IFAT（44.9%）和血液涂片法（31.3%）[74-75]。Hoghooghi-Rad以环形泰勒虫18SrRNA基因序列设计引物，采用半巢式PCR技术检测了采自伊朗戈勒斯坦省160份外观健康的本地黄牛的血液样本，得出环形泰勒虫阳性率为7.5%[76]。Ros-García等人于2012年9 托克逊县部分地区牛环形泰勒虫病的流行病学调查首次建立了环形泰勒虫病的实时荧光定量PCR方法和寡核苷酸探针悬浮芯片法。据报道，前者最低可检测到100个基因拷贝，灵敏度为1μL血液10个梨形虫；后者敏感性比RLB更高，灵敏度为1μL血液0.05个梨形虫，可进行快速、高通量的筛选[77-78]。在国内，2009年简子健等建立了环形泰勒虫Tams1基因的巢式PCR诊断方法，指出该方法可以用于环形泰勒虫的大规模流行病学调查[79]。罗金等、王振宝等于同年以环形泰勒虫Tams1基因标准阳性质粒为模板建立了二温式-PCR检测方法，血液中感染虫体的检测量分别为0.31fg/μL和34fg/μL，并分别对甘肃、新疆地区牛血样进行检测，检出率分别为16.3%和58%[80]。郭庆勇等以环形泰勒虫18SrRNA基因为靶基因，通过优化反应参数，建立了实时荧光PCR诊断方法，该法最低可检出10拷贝的核酸[81]。1.2.3.2反向线性杂交技术（RLB）反向线性杂交技术（RLB）是通过将含有放射物质或生物素标记的PCR扩增产物与膜上的特异性探针杂交后显影，从而鉴定不同病原。RLB技术也是近年来应用较多的技术，该技术可同时检测多种病原，尤其在血液原虫的检测中应用广泛，对检测混合感染的样品有着其他检测方法不可比拟的优势。其原理是将特异性的探针固定在带负电荷的杂交膜上，将PCR引物用放射性物质或者生物素标记，之后PCR扩增目的基因；并将扩增的PCR产物与膜上的特异性探针杂交，用放射显影或光生物素显影，以确定PCR产物中核酸序列差异，从而鉴定不同病原。该法由于使用了特异性探针，因此特异性非常好，同时还克服了常规PCR只能检测单一感染虫体的缺陷。但是该技术在人员和设备方面有较高的要求。1988年Saiki等人首次报道该方法。Gubbels等人于1999年在泰勒虫属及双芽巴贝斯虫18SrRNA基因V4高变区序列差异的基础上，采用RLB技术，成功地从西班牙血液样品中检测并区别了环形泰勒虫、东方泰勒虫、双芽巴贝斯虫[82]。2006年，Ali等采用RLB技术调查了苏丹162头奶牛梨形虫的感染情况，结果检出率为65.4%，与PCR方法的符合率为73.4%[83]。1.2.3.3环介导等温扩增反应（LAMP）环介导等温扩增技术（LAMP）是日本学者Notomi等人于2000年发明的一种新型的核酸扩增技术。该技术是寻找定位靶基因上6个区域，然后针对设计出4条扩增引物，将一种特殊的链置换DNA聚合酶（BstDNA聚合酶），在一定的温度（一般为60℃～10 新疆农业大学硕士学位论文65℃左右）下，1h内的扩增效果可达到109～1010个之多[84-86]。Salih等人首次将LAMP技术应用于环形泰勒虫病的诊断上，根据环形泰勒虫假定蛋白的核酸序列设计了3对特异性引物，阳性检出率为60.7%，而RLB检出率为62.3%[87]。刘爱红等在环形泰勒虫18SrRNA和ITS序列的可变区分别设计两对特异性引物建立了两种LAMP检测方法，最低可检出0.1pg/μL的基因组DNA。临床验证结果显示，环形泰勒虫病检出率为24.5%（常规PCR为18.2%）[88]。1.5牛环形泰勒虫病的防治1.5.1治疗本病目前尚无特效药物治疗，但发病早期如果选择使用效果好的药物，再配合相应的对症疗法，同时加强饲养管理，可以大幅度降低死亡率。药物治疗：磷酸伯氨喹啉（焦虫散）按0.75mg/kg～1.5mg/kg的剂量口服，每天一次，连用三天；贝尼尔（三氮咪，血虫净）按5mg/kg～7mg/kg的剂量配成5%～7%的溶液肌肉注射，每天一次，连用三天，如果红细胞染虫率还不下降，可继续使用两次。对于情况较严重的病牛应配合全身治疗，多补液，注射VC、VB1、VB12等营养元素和能量，调节平衡，增强自身抵抗力。同时要加强饲养管理，增加饲料营养。对症治疗：即使虫体被消灭，但虫体对病牛已经产生损害，病情依然很难恢复，所以必须及时进行对症治疗，如强心补液、促进反刍、止泻止血、健胃消食等。若病牛的红细胞数和血红蛋白量显著降低，需进行输血治疗。犊牛输血量500ml～2000ml，成年牛输血量1500ml～2000ml，每天一次，情况严重则两日输一次。1.5.2预防对于该病的预防首先要做好灭蜱工作。灭蜱的最佳时间可分两次进行，第一次在第一年12月～第二年1月，是蜱的若虫在牛体越冬期；第二次是在5月～7月，是蜱虫的吸血期。可使用表面缓释杀虫油剂进行灭蜱[89]。在每年8月～9月是蜱产卵期，在圈舍使用药物灭蜱时墙缝是关键，可将墙缝填平来闷死雌蜱幼虫。11 托克逊县部分地区牛环形泰勒虫病的流行病学调查在该病流行区可使用牛环形泰勒虫的疫苗进行预防，裂殖体胶冻细胞苗可以起到很好的免疫效果，接种后20d即可产生免疫力，免疫期可达一年。如果到发病季节担心免疫效果无法保证，可用贝尼尔按3mg/kg配成7%的溶液进行药物免疫肌注，每20天一次。1.6本课题研究的目的意义养牛业是新疆的主要经济支柱之一，近年来养牛户更是不断增加，牛环形泰勒虫病在各地被相继报道，成为了养牛业的一大难题,长期给人们造成不小的困扰和损失，是新疆发展畜牧业和草地畜牧业迫切需要解决的问题。但目前，传统而落后的防治办法仍一直被用于牛环形泰勒虫病的诊治，尚未调查了解该病在我区的流行情况就盲目用药，最终导致牛泰勒虫及其媒介蜱的耐药性增加，感染率居高不下，反而呈现不断上升的趋势，而且兽药的滥用造成动物源性产品中有害化学物质的残存，这不仅对人体生命造成重大威胁，而且对畜牧业的良性发展和生活环境也造成不可挽回的损失。加之我区各地基层兽医部门对牛环形泰勒虫病的诊断依赖于临床诊断和血液涂片检查法，诊断技术滞后，使得诊断效率和准确性不尽如人意。长时间下来牛环形泰勒虫病的流行已在我区形成了可怕的恶性循环，不利于控制和根除。所以，本研究从养牛业的生产实际出发，在吐鲁番托克逊县部分地区开展牛环形泰勒虫病的地方流行规律调查研究，包括验证该病的传播媒介蜱在我区的分布种类，揭示该地易感牛群的感染特性，统计各养牛户的感染情况，同时对两种诊断技术进行对比，建立更加特异灵敏的诊断技术，更好地对牛环形泰勒虫病进行检测和监控，从而达到减少或抑制疫情爆发流行的目的，为托克逊县部分地区牛环形泰勒虫病及媒介蜱虫的综合防控提供技术支撑，具有重要的实际意义。12 新疆农业大学硕士学位论文第2章托克逊县夏乡南湖村牛环形泰勒虫病的调查情况新疆自从大力发展畜牧业以来，经济突飞猛进，吐鲁番地区由于天然的环境气候和丰富的自然资源，更是成为新疆代表性发展的重点区域。牛奶的普及更是使得养牛业飞速发展。养牛户的增加推动了畜牧业的前进，但同时导致各种寄生蜱的大量繁殖与传播，给养牛户带来不小的损失，严重阻碍养牛业的可持续发展。近年来，赵建新、沙塔尔·卡哈尔等人对吐鲁番地区进行过流行病学调查，建立了牛环形泰勒虫病的流行病学资料，感染情况均不容乐观，养牛业的前景堪忧。所以，托克逊县作为牛环形泰勒虫严重感染地区之一，流行病学调查的建立刻不容缓，通过调查各养牛户相关信息，采集寄生蜱、牛全血，整理最新的感染情况和有效数据，完备托克逊县的流行参考资料，建立方便快速的血液涂片诊断方法，为该病提供一定的防治依据。2.1试验材料2.1.1试验动物2014年5月5日吐鲁番托克逊县夏乡南湖村随机养殖户的不同年龄段的牛只，共104头，并记录牛只编号和年龄。2.1.2采蜱检查牛只的耳部、腋下、股内侧、颈肩部、肛周、会阴、尾根等处，采集体表的寄生蜱，保存在标本瓶内。在采集吸血蜱时，用镊子夹住蜱虫假头部，垂直于皮肤方向缓缓向外摇动，防止假头断于皮肤内。也可使用氯仿、乙醚等药物涂抹于蜱虫吸血部，等蜱麻醉再进行采集[90]。采集完毕后，将蜱投入100度沸水中杀死并让肢体得到充分伸展。然后取出蜱投入早已准备好的配有75%酒精的标本瓶中保存，为防止蜱的肢体发硬变脆，可在酒精中加入数滴甘油。2.1.3采血绳索保定牛，牛鼻钳夹住头颈，于颈静脉沟上1/3与中1/3交界部剪毛，用手按压颈部下方，用碘伏和酒精棉球分别对鼓起的颈静脉进行消毒，如果不剪毛用手触摸，感13 托克逊县部分地区牛环形泰勒虫病的流行病学调查觉圆滑有弹性即为血管。另一手执无菌采血器，针头与皮肤呈45度角由下方向上方刺入，微微调整至出血，另一头接好抗凝管，每头牛采血5ml，待量达到要求后，拔下针头，用消毒棉球按压针眼，消毒止血。2.1.4试验器材镊子、标本瓶、长柄金属小棒、甲醇、干净载玻片、香柏油、采样箱、牛鼻钳、绳子、签字笔、记号笔、采样单、手套75%、酒精、碘伏、一次性无菌采血器、抗凝管、显微镜（OLYMPUSKC257017）。2.2试验方法2.2.1蜱的鉴定将采集的蜱用蒸馏水冲洗干净，固定于75%酒精内。根据相关的资料，取蜱置于载玻片在解剖镜上进行分类和鉴定，观察蜱标本的假头基、盾板、基节、有无眼、肛侧板、气门板等结构。2.2.2血液涂片法第一，用吸管取血1滴，滴于一干净的载玻片一端，取另一边缘较光滑的干净载玻片作为推片，置于血滴前向着血滴缓缓移动，一碰到血滴后立刻稍顿，血滴会沿推片边缘向两边流动，将推片的边缘与载玻片呈一定角度以免两玻片相吸贴在一起，然后一边推片一边观察载玻片上的血膜厚度，推片最后要快速向上挑起，一层血膜便出现在眼前。待血膜自然风干后，用铅笔在血膜的一侧注上相应的编号。第二，将干燥后的载玻片整齐置于染色缸上的并排玻璃棒上，加甲醇2滴～3滴，使覆盖整个血膜，固定至血膜再一次晾干。然后用稀释好的姬姆萨尔染液染色2min～3min。第三，染色结束后，将涂片用蒸馏水冲洗至淡粉色，多余水分自然晾干，也可用过滤纸吸干，最后将涂片置显微镜下，用100倍的镜头进行油镜镜检。14 新疆农业大学硕士学位论文2.3试验结果2.3.1蜱的鉴定结果通过解剖镜鉴定，发现寄生蜱为璃眼蜱属的小亚璃眼蜱(图1-2)。小亚璃眼蜱（Hyalommaanatolicumanatolicum）雄蜱（♂）体型较小，眼突出明显，假头基大而长，基突粗短；盾板中部隆起，后中沟浅，后缘达不到中垛；中垛一般明显，淡黄色或与盾板同色；肛侧板后缘圆滑，前端尖窄，但中部较宽，像水滴，内缘突角宽短；肛侧板下方为窄小的肛下板，肛沟在肛门后方环绕。足细长，基节Ⅰ的外距显著长于内距，基节Ⅱ～Ⅲ无内距，外距短小，呈齿状，基节Ⅳ内外距短小，背缘浅色纵带。雌蜱（♀）体型小，眼突出明显，假头基短，基突不明显，须肢窄长，刻点少而浅。颈沟短浅，气门板呈长方形，生殖孔隆起，肛沟于后方包围着肛门，背突宽长，呈直角弯曲。足细长，基节Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ与雄蜱无明显区别，关节附近有淡色环带。1:颈沟2:假头基后缘3:后中沟4:肛沟5:须肢第二基节6:须肢第三基节7:气门板8:肛侧板9:肛下板图1-2小亚璃眼蜱Fig.1-2Hyalommaanatolicumanatolicum2.3.2血液涂片结果104份血液涂片镜检结果显示，有53份样品在视野中发现了许多圆点状或戒指状的15 托克逊县部分地区牛环形泰勒虫病的流行病学调查虫体（图1-3），即环形泰勒虫，所以托克逊县夏乡南湖村牛环形泰勒虫的血液涂片检测感染率为51.0%。其中有4张涂片由于操作染色等原因无法有效识别，成为废片。A：戒指状B：圆点状图1-3牛血液涂片检测结果Fig.1-3BovinebloodpicturedetectionresultsA:RingShapeB:DotShape2.3.3不同年龄段牛环形泰勒虫血涂片的感染情况所检测的104份样品中，73份有年龄标记。其中，0月～6月龄15份、7月～12月龄4份、1岁～2岁5份、3岁以上的样品14份，其感染率分别为71.4%、33.3%、45.5%、48.3%，结果表明，在血液涂片检测中，0～6月龄的牛对环形泰勒虫的感染率最高，为71.4%（表1-1）。表1-1不同年龄牛环形泰勒虫血涂片的感染情况Table1-1TheinfectionofdifferentagecattleringTaylorwormbybloodsmear阳性数阴性数感染率年龄（n）被检份数PositiveNegativeTherateofAge(n)Detectedcopiesnumbernumberinfection0