急性大鼠脊髓损伤的蛋白组学初步研究

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1、分类号：R681.5学校代码：10062密级：学号：2012602819硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：急性大鼠脊髓损伤的蛋白组学初步研究TITLEThePreliminaryProteomicStudyofAcuteSpinalCordInjuryinRat一级学科：临床医学二级学科：外科学骨科论文作者：姚立炜指导教师：冯世庆教授天津医科大学研究生院二〇一五年五月分类号：R681.5学校代码：10062密级：学号：2012602819学位类别：科学学位专业学位学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：急性大

2、鼠脊髓损伤的蛋白组学初步研究TITLEThePreliminaryProteomicStudyofAcuteSpinalCordInjuryinRat一级学科：临床医学二级学科：外科学骨科论文作者：姚立炜指导教师：冯世庆教授导师组成员：天津医科大学研究生院二〇一五年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学

3、位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日天津医科大学硕士学位论文中文摘要【目的】通过比较裂解液法、TCA-丙酮法和酚抽提取法提取大鼠脊髓蛋白的效率，选择最适合的大鼠脊髓蛋白提取方法；研究大鼠急性脊髓损伤前后差异表达的蛋白质，分析这些

4、蛋白质生物学功能，为更加深入的了解脊髓损伤后复杂的病生理过程提供理论依据。【材料和方法】本实验提取正常雌性Wistar大鼠T10前后1cm的脊髓组织，分别采用裂解液提取法、TCA-丙酮提取法和酚抽提取法提取脊髓蛋白，通过比较Bradford法测量蛋白质的浓度，SDS-PAGE电泳和双向电泳分析提取蛋白的种类和数量，选择适合大鼠脊髓蛋白提取的最佳方案。成年雌性大鼠9只，随机分成3组，每组3只。对照组不进行脊髓打击，仅采用同等剂量进行麻醉，椎板切除后直接取材。实验组采用IMPACTORMODEL-Ⅱ打击器建立T10脊髓损伤模型（打击力度为10g×25mm），根据取材时间的不同分成

5、3h组和8h组。采用已经建立的大鼠脊髓蛋白提取方案提取蛋白，通过双向电泳技术分离各组提取的蛋白；采用PDQuest软件分析和比较对照组和实验组的胶图，寻找上调或者下调差异表达的蛋白；采用MALDI-TOF/TOF对这些蛋白质进行肽质量指纹图谱和二级质谱鉴定；通过NCBI和UniProtKB数据库对这些蛋白进行亚细胞定位和功能注解；STRING软件对差异蛋白进行通路分析。根据已建立的大鼠脊髓蛋白提取方案提取对照组，3h组和8h组蛋白质，通过WesternBlot技术对已鉴定的关键差异蛋白进行验证。【结果】1.与裂解液法和酚抽提取法相比，TCA-丙酮提取法提取蛋白在SDS-PAG

6、E电泳上有更多清晰的条带，在双向电泳上有这更多的蛋白斑点，所以本实验采用TCA-丙酮提取法为最佳大鼠脊髓蛋白提取方法。2.实验组和对照组相比，共有30个差异表达的蛋白。包括9个代谢相关蛋白，6个氧化应激蛋白，5个神经纤维束蛋白，3个骨架蛋白，3个能量相关酶，1个细胞转导蛋白，3个其它。其中11个上调，19个下调。3.GFAP蛋白在损伤后3h表达明显下降，8h表达量开始回升，与双向电泳I天津医科大学硕士学位论文的实验结果相符。结论本研究发现TCA-丙酮蛋白提取法最适合大鼠脊髓蛋白提取，应用蛋白组学技术筛选急性大鼠脊髓损伤前后的蛋白，绘制差异表达的蛋白谱，寻找潜在的与脊髓损伤相关

7、的特异分子标志物和探索脊髓损伤后复杂级联病生理机制，为将来进一步脊髓损伤的治疗提供可靠的实验依据。关键词：脊髓损伤蛋白提取蛋白组学wistar大鼠GFAPII天津医科大学硕士学位论文AbstractObjectiveWeidentifiedanefficientprotocolforextractingproteinfromratspinalcordfor2-DE，amongphenol,TCA-Aandlysis.Toexplorethespecialproteinsthatweresignifica