微纳米磁颗粒对微量dna的提取及对dna片段的选择性分离

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1、上海交通大学博士学位论文微纳米磁颗粒对微量DNA的提取及对DNA片段的选择性分离学校:上海交通大学院系:生物医学工程学院班级:A0941691学号:0094169006博士研究生:何章勇专业:生物医学工程导师:古宏晨(教授)上海交通大学生物医学工程学院ADissertationSubmittedtoShanghaiJiaoTongUniversityfortheDegreeofPhilosophyDoctorMicro/NanoMagneticParticlesforTraceDNAExtractionandSelectiveSeparationofDNAFr

2、agmentsAuthor:ZhangyongHeSpecialty:BiomedicalEngineeringAdvisor:Prof.HongchenGuSchoolofBiomedicalEngineeringShanghaiJiaoTongUniversityShanghai,P.R.China上海交通大学博士学位论文摘要微纳米磁颗粒对微量DNA的提取及对DNA片段的选择性分离摘要硅羟基，氨基及羧基修饰的功能化磁颗粒由于其快速的磁分离和高效的核酸提取率已广泛用于DNA的分离和纯化。微量DNA的有效提取对于提高核酸分子检测灵敏度具有重要意义，如对疾病早期

3、的分子诊断等。本论文首先基于高灵敏度的核酸分子检测，以羟基和氨基修饰的氧化硅磁颗粒为核酸载体，研究了它们对于微量核酸的提取。其次，随着二代基因测序的迅速发展及外周血游离DNA的发现，目标DNA片段的快速准备已是必然要求。在此背景下，本论文研究了羧基修饰的氧化硅磁颗粒对DNA片段的选择性分离。本论文主要研究内容包括以下三个方面:ⅰ)以荧光定量PCR定量检测不同类型的羟基氧化硅磁颗粒对微量核酸（λDNA）的回收率，分析磁颗粒分散性，吸附-脱附过程振荡、脱附液体积及磁分离时间等因素对微量核酸回收率的影响；研究带入羟基氧化硅磁颗粒的PCR对提高核酸检测灵敏度的可行性；

4、ⅱ)以PCR和荧光定量PCR的方法，研究dNTP对氨基氧化硅磁颗粒结合微量核酸（λDNA）的置换脱附行为；研究氨基氧化硅磁颗粒对PCR扩增的影响，分析带入氨基氧化硅磁颗粒的PCR对提高核酸检测灵敏度的可行性；ⅲ)研究一定盐（NaCl）浓度下，羧第I页上海交通大学博士学位论文摘要基氧化硅磁颗粒对DNA片段的回收浓度（或回收率）与聚乙二醇（PEG）浓度的关系，建立确定羧基氧化硅磁颗粒沉淀DNA片段所需临界PEG浓度的新方法，并进一步建立羧基氧化硅磁颗粒选择性分离DNA片段所需NaCl和PEG浓度的新方法及对其生物医学应用进行初步研究。由上述研究工作得出结论如下:1

5、)羟基氧化硅磁颗粒对微量核酸的回收率较低且具有一定的波动性，氧化硅磁颗粒的分散性对微量核酸的回收率起主要决定作用，此外，吸附-脱附过程振荡、脱附液体积及磁分离时间等外部因素也影响着微量核酸的回收率，带入结合DNA的适量羟基氧化硅磁颗粒的PCR有利于提高核酸分子检测的灵敏度；2)dNTP对氨基氧化硅磁颗粒结合微量核酸的置换脱附与磁颗粒表面氨基密度，dNTP浓度及结合的核酸量相关，氨基密度越低，dNTP浓度越大，结合的核酸量越多，越有利于dNTP对与氨基结合DNA的置换脱附；3)羧基氧化硅磁颗粒对DNA片段的回收浓度（或回收率）与PEG浓度呈典型的S型曲线关系，并

6、可用Logistic函数(pyA(AA)/[1(x/x)])对该S型曲线拟2120合确定DNA片段沉淀到羧基氧化硅磁颗粒上所需的临界PEG浓度，通过该函数的一阶导数得到了回收率的斜率函数，建立了DNA片段回收率对应PEG浓度的回收谱，该回收谱可以用来确定用于DNA片段选择性分离所需的NaCl和PEG浓度.最后,根据该方法,本研究实现了羧基氧化硅磁颗粒对DNA片段的选择性分离在生物医学上的初步应用。第II页上海交通大学博士学位论文摘要关键词功能化磁颗粒，微量核酸，磁颗粒分散性，荧光定量PCR，DNA片段第III页上海交通大学博士学位论文MICRO/NAN

7、OMAGNETICPARTICLESFORTRACEDNAEXTACTIONANDSELECTIVESEPARATIONOFDNAFRAGMENTSABSTRACTFunctionalizedmagneticparticles,modifiedwithsilanol,aminoorcarboxylgroups,havebeenwidelyusedfortheseparationandpurificationofDNA,duetotheirrapidmagneticseparationandhighlyefficientDNArecovery.Effective

8、extractionoftraceDN