定点突变对苏云金芽胞杆菌cry11ba蛋白结构和功能的影响

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1、硕士学位论文定点突变对苏云金芽胞杆菌Cry11Ba蛋白结构和功能的影响学科专业微生物学学位类型科学学位专业学位研究生姓名王冶红导师姓名、职称夏立秋教授论文编号湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一五年五月湖南师范大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研巧工作所取得的成果。除文中已经注明引用的巧容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体。，巧己在文中明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签

2、名：曼７＾＞＾／Ｊ年ｂ月式曰湖南师范大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，研巧生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖馆师范大学。同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版。本人授权，允许论文被查阅和借阅湖南师范大学可Ｗ将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可心式采用影巧、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。？＞曰；兴作者签名：主冻）期扁＾月３曰导师签名一日期年谷月日＿义分类号Q939.9密级学校代码10542学号2

3、01202141169定点突变对苏云金芽胞杆菌Cry11Ba蛋白结构和功能的影响EffectsofSite-DirectedMutagenesisofCry11BafromBacillusthuringiensisontheStructureandFunction研究生姓名王冶红指导教师姓名、职称夏立秋教授学科专业微生物学研究方向应用微生物学湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一五年五月摘要苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis，简称Bt）是一种应用广泛的微生物杀虫剂。它的杀虫特性主要取决于芽胞期产生的大量杀虫晶体蛋白（I

4、nsecticidalCrystalProteins,ICPs）。目前，研究Bt杀虫晶体的分子结构对提高杀虫晶体蛋白的产量，增强Bt菌株杀虫毒力以及构建高效广谱的Bt工程菌株具有重要意义。而杀蚊虫晶体蛋白Cry11Ba的分子结构和作用机制有待深入研究。本研究利用ClustalX2和MEGA4.1软件比对Cry11Aa和Cry11Ba蛋白的氨基酸序列，在线调用DiANNA1.1WebServer预测Cry11Ba二硫键的位置，运用Swiss-Model软件建立Cry11Ba三维结构模型，确定Cry11BaC-端5个半胱氨酸和N-端结构域I141

5、~150位9个氨基酸为突变位点。利用寡核苷酸诱导的环形定点突变法对cry11Ba基因进行定点突变，将突变体在无晶体突变株Bt4Q7中表达，进行相差显微镜观察、蛋白表达、溶解性分析、胰蛋白酶稳定性分析及杀蚊生物活性测定。C-端5个突变工程菌都能形成典型的椭圆形晶体并表达81kDa的目的蛋白，其晶体蛋白在缓冲液中的溶解性提高。C714S晶体蛋白对胰酶更敏感，但它们对致倦库蚊的毒力都明显降低。结果表明半胱氨酸叠加突变不影响椭圆形晶体的形成和蛋白的高效表达。溶解性显著提高可能是因为引入的Ser残基带有亲水性基团（-OH）。根据二硫键的预测结果，由于C

6、ys652参与二硫键的形成，二硫键破坏使空间结构不稳定，最终导致毒力下降。N-端9个突变工程菌也均能形成椭圆形晶体。I142A晶体减小，G147A、V148A、I150A形成1-2个晶体蛋白，这可能是蛋白在形成过程中发生了错误折叠。I142A表达的蛋白约为60kDa，可能是因为该位点突变导致基因非连贯性表达无法形成完整的Cry11Ba。其他突变体均表达81kDa的目的蛋白，表明这8个位点的突变不影响Cry11Ba的表达。除I142A以外，突变前后晶体溶解性差异不显著。胰酶稳定性分析I142A表达的蛋白不能降解成活性片段，Y145A、IE146

7、A、G147A、S149A表达的蛋白对胰酶稳定性提高，表明这4个位点氨基酸的改变可能导致其对胰酶的消化作用敏感性降低。G144A对致倦库蚊和埃及伊蚊的LC50分别提高了1.84倍和3.31倍，其他8株工程菌对致倦库蚊和埃及伊蚊的LC50均降低。本研究构建了13株具有潜在应用价值的突变工程菌株，深入探讨了cry11Ba基因结构变化对杀虫功能的影响，在杀蚊晶体蛋白分子结构改变引起杀蚊功能改变方面获得了有力的佐证。同时，成功获得了1株毒力提高的突变工程菌株G144A，为构建高效Bt基因工程菌株提供技术支持，为后续Bt杀蚊基因功能域突变位点的选择和优

8、化奠定了重要基础，对微生物杀虫剂的开发和应用具有借鉴作用。关键词：苏云金芽胞杆菌；定点突变；Cry11Ba；杀蚊活性；二硫键IIAbstractBacillusth