失代偿性肝硬化患者骨髓间充质干细胞对t淋巴细胞的免疫调节作用

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1、知A#SOOCHOWUNIVERSITY博士专业学位论文论文题目失代偿性肝硬化患者骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫调节作用研究生姓名郭春辉指导教师姓名甘建和专业名称内科学（传染病学)研究方向间充质干细胞治疗肝衰竭的基础与临床论文提交日期2013年3月苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出

2、重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：^学位论文使用授权声明本人完令了解苏州大学关亍收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权们厲苏州大f。木学位论文电子文枰的内容和纸质论文的内容相-致。苏州人学W权向U;丨家图书ffi、中Dil社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社）、屮_，术期刊（光攛版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被奄阅和借阅，可以采IT丨影印、缩印或坑他E制下段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据f

3、f:进行检索。涉密论文口本学位论文属在_____年_片解密后适用本规定^非涉密论文口m：^11期：失代偿性肝硬化患者骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫调节作用中文摘要失代偿性肝硬化患者骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫调节作用中文摘要第一部分：失代偿性肝硬化患者骨髓间充质干细胞的分离、培养及其生物学特性的研究目的：建立失代偿性肝硬化患者骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）体外培养体系，并探讨其生物学特性。方法：采用密度梯度离心和贴壁培养法相结合,培养基为含自体血清间充质干细胞培养基，从失

4、代偿性肝硬化患者骨髓中分离培养间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs），观察骨髓MSCs的培养成功率、原代培养时间，测定生长曲线，流式细胞仪分析鉴定MSCs的纯度。结果：失代偿性肝硬化患者BMSCs的体外分离培养成功率100％（9/9）；BMSCs的原代培养时间为（13.0±2.3）天，传代培养时间（8.4±1.7）天；BMSCs具有相似的形态，均呈梭形，成纤维细胞样细胞，P3代骨髓间充质干细胞的纯度可达95%，其高表达CD44(95.01％)、CD29(92.79％)，低表达CD34(1.31％)、CD45(1.0

5、8％)，符合MSCs的免疫学特征。结论：肝硬化患者来源的MSCs具有MSCs的共同生物学特性，使用自体血清培养基体外培养的肝硬化患者BMSCs生长稳定，增殖旺盛,能连续传代，可能是替代原位肝移植（orthotopiclivertransplantation,OLT）的理想的“种子细胞”。关键词：肝硬化；骨髓间充质干细胞；培养；生物学特性第二部分：失代偿性肝硬化患者骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫调节作用目的：探讨失代偿期乙型肝炎肝硬化患者骨髓MSCs对自体外周血T淋巴细胞的免疫调节作用。方法：分离失代偿性肝硬化患者外周血淋巴细胞行羧基荧光素

6、乙酰乙I中文摘要失代偿性肝硬化患者骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫调节作用酸琥珀酰亚胺酯(carboxy-fluoresceindiacetatesuccinimidylester,CFDASE)荧光染色，在植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)刺激下，培养基为自体血清，自体外周血淋巴细胞与P3代BMSCs共培养，实验分四组：①BMSCs+淋巴细胞+PHA接触培养组；②BMSCs+淋巴细胞+PHA非接触培养组；③淋巴细胞+PHA阳性对照组；④单独淋巴细++-胞阴性对照组。流式细胞术检测各组淋巴细胞增殖情况和CD4CD25

7、CD127调节性T+-+细胞（regulatoryTcells,Tregs）及CD4CD8IL-17辅助性T细胞17(Thelper17cell,Th17)细胞频数，逆转录聚合酶链反应（reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR）检测BMSCs的白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)及转化生长因子-β1（transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)mRNA表达水平。结果：流式细胞术显示：1.接触培养组及非接触培养组的细胞增殖较阳性对照组

8、明显减低（P<0.01），但亦显著高于阴性对照组（P<0.01），其组间比较，淋巴细胞增殖无显著差异（P>0.05）；2.接触培养组及非接触培养组Tregs细胞频率