大菱鲆养殖环境细菌多样性分析及水产病原菌基因芯片检测体系的构建

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1、分类号.密级.UDC编号学位论.文大菱鲆养殖环境细菌多样性分析及水产病原菌基因芯片检测体系的构建朱鹏飞指导教师__王宗灵研究fl曲凌云申请学位级别硕士学科专业名称海洋生物举论文提交日期2015年6月论女答辩日期201S年6月学位授予单位国寂淮洋届第一沲洋研究所国家海洋局第一海洋研究所二O—五年六月分类号____________________密级____________________UDC______________________编号____________________学位论文大菱鲆养殖环境细菌多样性分析及水产病原菌基因芯片检测体系的构建朱鹏飞指导教师＿王宗灵

2、研究员曲凌云研究员申请学位级别＿＿＿硕士＿＿＿学科专业名称＿海洋生物学＿论文提交日期＿2015年6月＿论文答辩日期2015年6月学位授予单位＿＿国家海洋局第一海洋研究所＿国家海洋局第一海洋研究所二〇一五年六月大菱鲆养殖环境细菌多样性分析及水产病原菌基因芯片检测体系的构建学位论文完成日期:如/[指导教师签字：d秘乏答辩委员会成员签字：料棘(SA原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以

3、明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名日期：年6月日学位论文使用授权说明本人完全了解国家海洋局第一海洋研究所关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照本所要求提交学位论文的印刷本和电子版本•，研究所有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；研究所可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；研究所同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务；同时授权清华大学“中国学术期刊(光盘版）电子杂志社”编入《中国优秀硕士学位论文全文数据库》和CNKI《中国知识资源总库》进行电

4、子与网络出版。(保密论文在解密后遵守此规定）论文作者签名导师签名：曰期：年（月/]曰大菱鲆养殖环境细菌多样性分析及水产病原菌基因芯片检测体系的构建摘要为完善水产病害预警监测机制，本文在使用宏基因组测序技术、分离培养及分子靶标鉴定等手段对海水养殖系统中的致病菌或潜在病原菌存在情况、大菱鲆幼鱼肠道及其养殖环境菌群结构进行研究的同时，针对水产养殖高度集约化趋势及水产病害频发的现状，结合历史文献资料，尝试构建检测灵敏度高、检测通量大且较为经济的病原菌基因芯片技术，为实现工厂化养殖过程中的疾病监测和预警提供技术支持。本论文对2013~2014年间发生在山东胶南的大菱鲆幼鱼腹水症

5、病原菌进行分离鉴定。结果从三批患腹水病的幼鱼体内分离多种优势菌株，经人工感染实验，发现有一株菌株能够使大菱鲆幼鱼产生腹水、死亡现象，经过16SrRNA基因、gyrB基因测序比对，将该株菌鉴定为铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa，其半致死浓度为3.6×108CFU·mL-1，此为首次报道该菌能够感染大菱鲆幼鱼。以溶血为表征对山东近岸养殖环境中的潜在条件致病菌进行的筛查结果为：从养殖环境中分离鉴定出19株溶血弧菌，以属于灿烂支系（11/19）、哈维支系（6/19）的弧菌居多，且存在多种已报道的水产病原菌，如哈维氏弧菌、溶藻弧菌、欧文氏弧菌等。通过人工感

6、染实验发现两株欧文氏弧菌、一株哈维氏弧菌表现出一定的毒力，并经过毒力基因检测发现该三株菌均含有哈维氏弧菌溶血素编码基因vhhB的同源基因，说明在近岸养殖环境中存在潜在的条件致病菌。此外通过对分离弧菌的分子鉴定靶标比较，发现铁摄取调节蛋白编码基因fur显示出较好的分类靶标作用，可以作为弧菌属分子鉴定的靶标基因。通过对大菱鲆幼鱼肠道及其养殖环境菌群结构进行分析发现，相比于大菱鲆幼鱼肠道，养殖水体中细菌多样性更高，其中假交替单胞菌属Pseudoalteromonas、交替单胞菌目某属unclassifiedAlteromonadales、假单胞菌属Pseudomonas、弧

7、菌属Vibrio、别弧菌属Aliivibrio的比例较为一致；而在大菱鲆样本中弧菌属占优势I地位，其次为假单胞菌属。在结合上述研究结果和结合文献资料分析的基础上，本论文构建了能够检测9种水产病原菌的31种基因的基因芯片，经检测其探针特异性为100%，对亲缘关系较近的菌株间没有出现交叉反应，通过对患病大菱鲆样本检测对比，发现基因芯片检测的灵敏度较好，能够分辨出PCR技术检测不出的基因。此外基于多重PCR技术，还对基因芯片检测体系进行优化。确定当杂交温度为60℃、杂交时长为2h、探针浓度为4μmol·L-1、Cy3标记的随机引物的用量为150pmol时，