基于慢病毒的输卵管特异表达人溶菌酶转基因鸡制备

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1、分类号：单位代码密级学号：博士学位论文基于慢病毒的输卵管特异表达人溶菌酶转基因鸡制备研究生曹代男指导教师胡晓湘教授申请学位门类级别理学博士专业名称遗传学研宄方向动物分子遗传学所在学院生物学院二零一五年六月ChinaAgriculturalUniversityPh.D.DissertationTheGenerationOfTransgenicChickensOviduct-specificExpressingRecombinantHumanLysozymeByLentivirusPh.D.Candidate:DainanCaoSup

2、ervisor:Prof.XiaoxiangHuMajor:GeneticsCollegeofBiologicalSciences,ChinaAgriculturalUniversityBeijing100193,ChinaJun2015独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中已经注明引用和致谢的内容外，论文中不包含本人和其他人已经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在

3、论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：时间：年月日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定。本人同意中国农业大学有权保存及向国家有关部门和机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人同意中国农业大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》或《中国优秀硕士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。保密的学位论文在解密后应遵守此协议）学位论文作者签名：时间：年月？日导师签名：掷年月，日中国农业大学博士学位论文摘要摘要由于禽类独特的生殖系统

4、，一个新生种鸡蛋己经是一个包含六万个左右细胞的鸡胚。鸡蛋的外壳坚硬，鸡蛋黄大而脆弱，不像哺乳动物的卵子是透明的从而便于显微注射操作。近年来随着慢病毒的广泛应用和鸡原始生殖细胞的成功培养，转基因鸡的制备主要使用慢病毒注射和鸡原始生殖细胞转移法这两种方法，获得的代转基因鸡外源基因的嵌合率高达。目前有细菌内酰胺酶，人类单克隆抗体和单链融合蛋白等几种重组蛋白成功地在转基因鸡蛋清中表达本研宄成功地利用慢病毒制备了在蛋清中表达重组人溶菌酶的转基因鸡。溶菌酶（又称胞壁质酶或乙酰胞壁质聚糖水解酶，广泛存在于牛奶，唾液，哺乳动物泪水以及禽类蛋白中。

5、鸡溶菌酶（由个氨基酸残基组成，分子质量为人溶菌酶（由个氨基酸残基组成，分子质量为这两种蛋白的组成氨基酸有的同源性。尽管这两种溶菌酶的组成如此相近，人溶菌酶的抗菌活性却是鸡溶菌酶的三倍。人溶菌酶具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，并且对人体完全无毒害、无副作用，是一种安全的抗感染物质和天然防腐剂，也是婴儿食品、饮料的良好添加剂。然而，天然的人溶菌酶只能从乳汁、尿液、中性粒细胞和胎盘中少量提取，利用鸡输卵管生物反应器则有望低成本、大规模地生产人溶菌酶；同时，鸡蛋清的抗菌能力主要归功于溶菌海的存在，因此，鸡蛋中增加人溶菌酶成分能增加鸡蛋的抗

6、菌能力从而延长食品蛋的货架期和种蛋的储存期，有利于食品蛋的保存和运输以及规模化育种，具有重大的潜在经济效益。在本研究中，我们构造了一个基于复制缺陷型慢病毒的载体，该载体利用一个克隆的在输卵管特异表达的鸡卵清蛋白启动子调控表达一段人工合成的人溶菌酶序列，人溶菌酶序列前端还插入了一段人工合成的鸡溶菌酶信号肽。通过显微注射将包装好的慢病毒导入至期的鸡胚胚盘下腔，我们成功的获得了生殖系嵌合的代转基因鸡。对代公鸡精液的和定量检测结果表明外源基因在精液的嵌合度为。我们挑选了只精液阳性的公鸡与野生型白来航母鸡配种，检测了只⋯代雏鸡中外源基因的插

7、入情况，其中只（被鉴定为阳性鸡。检测的结果表明代中唯一的一只转人溶菌酶母鸡蛋清中重组人溶菌酶的表达量为±代转人溶菌酶公鸡家系的代转人溶菌酶母鸡蛋清中重组人溶菌酶的表达量为±对代和代转人溶菌酶母鸡蛋清的和免疫荧光检测证实了在我们获得的转基因鸡中，外源基因能种系传递并且持续地在鸡输卵管中表达。对代转人溶菌酶母鸡和野生型白来航母鸡各组织的和输卵管组织的免疫荧光实验说明了重组人溶菌酶只特异地在输卵管组织中表达，具有组织特异性表达。本研究采用显微注射慢病毒法成功地获得了在鸡输卵管稳定地表达人溶菌酶的转基因鸡。转基因母鸡输卵管是一种较转基因哺

8、乳动物系统更具经济效益的生物反应器，这项研宄的结果可以为转基因母鸡生产药用蛋白等应用提供参考。关键词：重组人溶菌酶，转基因鸡，慢病毒屮国农业大学博丄学位论文】土中国农业大学博士学位论文士，中国农业大学博士学位论文英文缩略词英文縮略词缩写英文全称中文