逆转录病毒法制备鸡输卵管生物反应器的前期探索

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1、ClassifiedIndex:Q786U.D.C:570.083.2DissertationfortheMasterDegreeinScienceTHEPRE-EXPLORATIONOFESTABLISHINGCHICKENOVIDUCTBIO-REACTORBYRETROVIRUSCandidate：ShanChongliSupervisor：AssociateProf.ChenYanAcademicDegreeAppliedfor：MasterofScienceSpeciality：GeneticsAffiliation:LifeScienceandEngine

2、eringDateofOralExamination：July,2007Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology哈尔滨工业大学理学硕士学位论文摘要基于禽蛋生物反应器独特的优点，转基因鸡输卵管生物反应器已成为转基因动物和生物制药研究领域中最有活力的热点。本研究首先分别探索了17月龄、6-9月龄以及激素刺激的雏鸡的输卵管上皮细胞的原代培养。通过脂质体转染法、CaCl2转染法以及电击转染法进行上皮细胞转染条件的摸索，其中以电击转染法最为有效，可以达到3-5%的转染效率。其次，本研究以增强型绿色荧光蛋白

3、(eGFP)为报告基因，以人类促红细胞生成素（hEPO）为目的基因。在PCR扩增1.1kb鸡卵清蛋白5′调控序列（OV）、GFP、sGFP、EPO等基因序列基础上，将上述DNA片段连入pMD-18T载体，经筛选得到正确连接方向的重组子后，再经酶切、连接后，构成调控序列（OV）与基因片段（GFP、sGFP、EPO）的正确衔接。再通过酶切反应，将上述衔接片断切下，连入逆转录病毒表达载体pLNCX，构建的阳性载体分别命名为pLN-OV-GFP、pLN-OV-sGFP、pLN-OV-EPO。最后，将能够表达MLV（莫洛尼鼠白血病病毒）Gag和Pol基因的质粒载体以脂质体转染法

4、转染HEK293细胞，经过抗性药物HisD（L-Histidinoldihydrochloride，L-组氨醇二盐酸盐）筛选，提取细胞基因组进行PCR鉴定，得到阳性细胞克隆。再将逆转录病毒表达载体pLN-OV-GFP、pLN-OV-sGFP经脂质体转染阳性克隆细胞，经G418筛选，提取细胞基因组进行PCR鉴定，得到整合有报告基因的病毒包装细胞系。综上所诉，本研究进行了不同鸡龄母鸡输卵管上皮细胞的原代培养，以及上皮细胞转染方法的摸索；成功构建了三个逆转录病毒表达载体；制备了能够表达MLV（莫洛尼鼠白血病病毒）的Gag和Pol基因以及逆转录病毒载体pLN-OV-GFP、p

5、LN-OV-sGFP的HEK293包装细胞系。旨在通过eGFP的表达来检测输卵管生物反应器系统的构建，为制作特异表达人类促红细胞生成素基因的鸡输卵管生物反应器奠定了基础。关键词鸡；生物反应器；输卵管；逆转录病毒；促红细胞生成素-I-哈尔滨工业大学理学硕士学位论文AbstractBecauseofit’sspecialadvantagestheresearchofchickenoviductbioreactorhasbeenoneofthefocioftransgenicstudiesandpharmacy.Atfirst,inthisresearch,weexplor

6、edtheprimarycultureofthechickenepithelialcellof17months,6-9monthschickenandthehormonestimulatedyoungchicken.Wetrytofindoutwhichmethodinfectedtheoviductepithelialcelleffectively.ThenwehadtriedLipofectininfectedmethod,CaCl2infectedmethodandtheelectro-pulseinfectedmethodandfoundthelastmeth

7、odisthebest.WeregardtheeGFPasreportgeneandthehEPOasthesubjectgeneinthisresearch.WePCRamplifiedthe1.1kbchickenovalbumin5'-flankingregulatoryregion(OV),GFP,SGFPandEPODNAsequenceandclonedthemintopMD-18Tvector.Therightligationhadbeensifted.Thenthroughdigestionandligationweobserveth