卵形鲳鲹toprx1和totrx1基因的特征和功能研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M120101030上海海洋大学硕士学位论文卵形鲳鲹ToPrx1和ToTrx1基因的特征和功题目：能研究CharacterizationandfunctionalanalysisofToPrx1英文题目：andToTrx1genesfromgoldenpompanoTrachinotusovatus专业：水产养殖研究方向：水产生物技术姓名：王龙指导教师：江世贵研究员上海海洋大学硕士学位论文卵形鲳鲹ToPrx1和ToTrx1基因的特征和功能研究摘要卵形鲳鲹（Trachinotusovatu

2、s）肉质鲜美，肌间刺少，蛋白含量高，是优质食用鱼。卵形鲳鯵可饲喂人工配合饲料，适合深水抗风浪网箱养殖和池塘养殖，已成为我国华南沿海最重要的海水养殖鱼类之一，近年来的年产量已接近10万吨。然而，由于在长期的人工繁育过程中未对亲本进行选育，导致卵形鲳鲹养殖群体抗病（逆）能力下降，在遇到环境胁迫时易导致病害爆发，造成重大的经济损失。因此，目前亟需深入研究卵形鲳鲹响应环境胁迫的免疫调控分子机制，为卵形鲳鯵抗病（逆）新品种培育和免疫防治技术的建立提供理论依据。有大量的研究表明，过氧化物还原酶和硫氧还蛋白在保护机体免受活性氧（RO

3、S）毒害方面具有十分重要的作用。本研究在前期转录组测序分析获得了卵形鲳鲹免疫相关基因过氧化物还原酶1（ToPrx1）和硫氧还蛋白1（ToTrx1）cDNA序列的基础上，分别分析了ToPrx1和ToTrx1系统发育关系；利用荧光定量RT-PCR技术检测了ToPrx1和ToTrx1在卵形鲳鲹不同组织中的表达模式；研究了ToPrx1和ToTrx1对卵形鲳鲹感染美人鱼发光杆菌的免疫调控作用；对卵形鲳鲹ToPrx1和ToTrx1两种蛋白进行体外重组表达，研究了两种重组蛋白的抗氧化活性，取得的主要结果如下：1.卵形鲳鲹过氧化物还原

4、酶1过氧化物还原酶1（Prx1）是生物体内一种重要的抗氧化蛋白，它可以保护机体免受活性氧等的侵害。本实验通过随机测序卵形鲳鲹cDNA文库获得了卵形鲳鲹Prx1（ToPrx1）cDNA序列，全长1049bp，5’端非编码区127bp，3’端非编码区328bp，有一个编码197个氨基酸多态的开放阅读框，为549bp；多重序列比对发现ToPrx1蛋白与其它物种的已知Prx蛋白具有很高的同源性（79-92%），并且ToPrx1包含了保守了Prx结构域和过氧化物酶活性中心；系统发育分析显示，卵形鲳鲹ToPrx1聚在硬骨鱼Prx1

5、簇，为典型2-Cys型Prx；卵形鲳鲹ToPrx1mRNA在受检测的心、胃、鳃等13个组织中都有不同程度的表达，在背鳍组织中表达量最高，在脾、肾脏、肠道、眼、鳃和血液中依次降低；对卵形鲳鲹进行美人鱼发光杆菌侵染实验后发现，ToPrx1mRNA在免疫相关组织肝、脾、肾和肠道中在不同时间点，都呈现不同程度的极显著上调；对卵形鲳鲹ToPrx1蛋白进行了体外重组表达，得到融合蛋白rToPrx1，并通过Ni-NTAHisBind进行纯化复性，最后通过Westernblotting技术进行了鉴定；对rToPrx1融合蛋白进行活性研

6、究，证实了II上海海洋大学硕士学位论文rToPrx1为巯醇依赖性蛋白，具有明显的抗氧化活性。2.卵形鲳鲹硫氧还蛋白1硫氧还蛋白1（Trx1）是保持机体细胞内环境氧化还原平衡的关键因素。本实验通过随机测序卵形鲳鲹cDNA文库，通过比对分析得到了卵形鲳鲹硫氧还蛋白1（ToTrx1）的cDNA序列，该cDNA序列全长786bp，开放阅读框324bp，编码107个氨基酸多肽，5’非编码区有116bp，3’非编码区346bp；卵形鲳鲹ToTrx1序列与其它物种已知Trx序列进行多重序列比对分析发现，ToTrx1含有一个硫氧还蛋白

7、家族高度保守的二硫键/巯基活性位点CGPC；卵形鲳鲹ToTrx1mRNA在受检测的心、胃、鳃、脑等13个组织中均有不同程度的表达，并在胃、鳃和背鳍组织中达到最大；对卵形鲳鲹进行美人鱼发光杆菌侵染实验后发现，ToTrx1mRNA在卵形鲳鲹免疫相关组织肝、脾、肾和肠道中，在不同时间点分别呈现出极显著上调；接着对卵形鲳鲹ToTrx1进行体外重组表达，得到融合蛋白rToTrx1，并且通过Ni-NTAHisBind树脂进行纯化复性，通过Westernblotting检测过后，最终得到具有活性的目的融合蛋白rToTrx1；最后通过

8、胰岛素减少实验对融合蛋白rToTrx1的二硫键还原活性进行了检测，证明了rToTrx1具有明显活性。本研究对卵形鲳鲹ToPrx1和ToTrx1基因序列进行了分析，克隆表达得到了卵形鲳鲹的rToPrx1和rToTrx1融合蛋白，验证了他们的蛋白活性及功能，同时探究了ToPrx1和ToTrx1的mRNA在卵形鲳鲹组织中的表达调控模式，