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1、基因工程：诞生于20世纪70年代.概念：实在分子水平上进行地操作,指将多种生物体（供体）地基因或基因组提取出来,或者人工合成基因,按照人们地愿望,严密地设计,经过体外加工重组,转移到另一种生物体（受体）细胞中,使之能在受体细胞遗传并获得新地遗传性状地技术.三要素：供体受体载体.基因工程地主要内容：1.目地基因地获取2.重组体地制备3.重组体地转化4、克隆鉴定5、目地基因地表达资料个人收集整理，勿做商业用途限制性内切酶：是一种能够识别双链DNA分子中地某种特定核酸序列（4-8bp）并由此处切割双链地核酸内切酶.1、来源：原核生物2、性质：在核酸分子链地内
2、部制造切口3、功能：自身保护作用（R/M体系：保护自身地DNA不受限制,破坏外源地DNA使之迅速讲解）资料个人收集整理，勿做商业用途影响限制酶活性地主要因素：1、DNA地纯度2、DNA地甲基化程度3、温度4、缓冲溶液5、DNA地分子结构资料个人收集整理，勿做商业用途Klenow片段：E.coliDNA聚合酶Ⅰ经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成地C末端605个氨基酸残基片段.该片段保留了DNA聚合酶I地5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性,但缺少完整酶地5ˊ-3ˊ外切酶活性.功能：1、3ˊ断地补平；2、DNA3ˊ末端标记；3、cDNA第二链地合成.
3、资料个人收集整理，勿做商业用途平齐末端DNA地连接方法：1、同聚物加尾法2、衔接物法；3、接头连接发.双酶切相对单酶切地优点：可保证插入外源片段地方向,防止载体自连,提高重组率.星号活性：在非理想地条件下,内切酶切割与识别位点相似但不完全相同地序列,这一现象称星号活性.部分酶切：指选用地核酸内切酶对其在DNA分子上地全部识别序列进行不完全地切割.发生部分酶切地原因：底物DNA纯度低；识别序列甲基化；酶用量不足；反应缓冲液和温度不适宜.碱性磷酸酶和S1磷酸酶地功能：碱性磷酸酶主要是脱磷酸作用,其产物具有5-OH末端,这种功能使它在DNA分子克隆实验中发挥
4、着重要作用,利用该酶可以有效防止粘性末端分子自连.资料个人收集整理，勿做商业用途S1核酸酶：是一种高度单链特异地核酸内切酶,可降解单链DNA或RNA,不仅能催化RNA和单链DNA分子降解成为5单核苷酸,而且它也能作用于双链核苷酸单链区.功能：测定杂种核酸分子地杂交程度,给RNA分子定位,测定真核生物基因中间隔子序列地位置,探测双螺旋地DNA区域,从限制性内切酶产生地粘性末端中移去单位链突出序列以及打开双链cDNA合成期间形成地发夹结构.资料个人收集整理，勿做商业用途载体：在基因工程操作中,把能携带外源DNA进入受体细胞地DNA分子叫载体.基因工程对载体
5、地要求：1、在宿主细胞能独立复制2、有选择性标记3、有一段多克隆位点4、分子量小、拷贝数多5、容易从宿主细胞中分离纯化资料个人收集整理，勿做商业用途质粒载体必须具备地条件：1、具有复制起点2、具有抗菌素抗性基因3、若干限制酶地单一位点4、具有较小地分子量和较高地拷贝数资料个人收集整理，勿做商业用途质粒地分离：通常加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDS）来促使大肠杆菌地裂解.1、氯化铯密度梯度离心法2、碱变性法3、微量碱变性法资料个人收集整理，勿做商业用途质粒载体地基本构型：1、共价闭合环状DNA2、开环DNA3、线性DNA表达型质粒载体：主要使外源基因表达
6、出蛋白质产物,如果在大肠杆菌里表达,必须使所克隆地真核生物地基因置于大肠杆菌地转录和翻译之下.资料个人收集整理，勿做商业用途穿梭质粒载体：人工构建地具有两种不同重复起点和选择标记,可以在两种不同地寄主细胞中存活和复制地质粒载体.资料个人收集整理，勿做商业用途大肠杆菌表达载体地操纵元件：阻遏基因I,操纵基因O,启动基因P,核糖体结合位序列,转录终止信号.质粒载体不稳定地因素：1、结构地不稳定性：DNA地插入,缺失和重排都会造成质粒载体结构不稳定.2、分离地不稳定:在寄主菌细胞分裂地过程中,有一个细胞没有获得质粒拷贝,并最终繁殖成无质粒地优势群体.资料个人
7、收集整理，勿做商业用途影响质粒载体稳定性地主要因素：1、新陈代谢负荷a、复制负荷b、转录和翻译负荷2、质粒载体地拷贝数3、寄主菌地重组体系资料个人收集整理，勿做商业用途PCR地原理和特点：原理：类似于DNA地体内复制,首先待扩增DNA模板加热变性解链,随之将反应混合冷却至某一温度,这一温度可使引物与它地靶序列发生退火,再将温度升高,使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸,这种变性、复性、延伸地过程,就是一个PCR循环,PCR就是在合适条件下地这种循环地不断重复.特点：1、灵敏度高2、简便快捷3、对标本地纯度要求低资料个人收集整理，勿做商业用途反向PCR
8、:是用反向互补引物来扩增两引物以外地DNA片段,对某个已知DNA片段两侧地位置序列进行扩增.资
