伏马毒素分离纯化及毒性试验研究

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1、学校代码：10264学号：M120208414上海海洋大学硕士学位论文题目：伏马毒素分离纯化及毒性试验研究英文题目：StudyonIsolationandPurificationandtheToxicityofFumonisins专业：食品科学与工程研究方向：食品质量安全姓名：郭文博指导教师：赵志辉研究员二O一五年六月上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发

2、表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□本学位论文属于，在年解密后适用本版权书。不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海

3、洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注答辩地点答辩日期年月日上海海洋大学硕士学位论文伏马毒素分离纯化及毒性试验研究摘要为了研究伏马毒素毒性作用，本试验研究了串珠镰刀菌在不同培养基上产毒量随时间的变化及伏马毒素的纯度，优化得到大米培养基为最适产毒培养基。在大米培养基上接种串珠镰刀菌得到大量产毒培养基，通过MAX固相萃取小柱对提取液净化，然后经过制备液相色谱分两步制备得到FB1、FB2、FB3。给BALB/c小鼠注射制备得到的FB1，观察小鼠体重、采食量、脏器系数、血常规以及血清生化指标。旨在填补我国FB1毒理学基

4、础研究的空白，为FB1的分离纯化和毒性作用机制的深入研究和畜禽生产中真菌毒素污染防控提供数据参考和理论依据。本试验主要研究内容和结论如下：（1）伏马毒素主要是由自然界的串珠镰刀菌（Fusariummoniliforme）产生的，本试验在4种不同培养基上接种串珠镰刀菌，PDA、PDB培养基26℃黑暗条件下培养15d，每3d采样一次；大米和玉米培养基培养5周，每周采样一次。通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）检测四种培养基中FB1、FB2的含量，结果表明：PDA与PDB培养基中FB1、FB2在第9d达到最大含量，但含量较低；玉米和大米培养基中FB1

5、、FB2在第28d达到最大，含量较高，大米培养基中FB1、FB2含量分别为817.08mg/kg、329.01mg/kg，玉米培养基中FB1、FB2含量分别为1143.40mg/kg、460.88mg/kg。紫外全扫描法对四种培养基提取液进行全扫描，结果表明：PDA、PDB中杂质峰明显少于大米、玉米，而大米中杂质峰又明显少于玉米。综上，在不影响制备效率的前提下，选择含色素等杂质较少的大米作为培养基，不仅有利于伏马毒素的分离纯化，还能延长色谱柱的寿命。（2）以大米作为培养基，接种串珠镰刀菌得到大量产毒基质，以MAX固相净化小柱作为产毒基质提取液的前处理净

6、化柱，通过UnitaryC18分析色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）借助LC-MS/MS对流动相、梯度进行优化，使FB1、FB2、FB3与杂质峰之间达到满意的分离度，然后等比例放大到制备色谱柱上，利用制备液相色谱分两步分离纯化得到大量FB1、FB2、FB3。所得伏马毒素经LC-MS/MS-+法定性鉴别，结果表明：在正负离子模式下（ESI和ESI）进行全扫描，均得到单一、高峰度的色谱峰。对特征峰在正离子模式下进行母离子扫描，FB1、FB2、FB3+++化合物的主要分子离子峰为722.30[M+H]、706.30[M+H]、706.30[M+H]；在

7、++ESI模式下分子离子峰722.30的主要二级碎片为352.30[M+H-2TCA-H2O]、334.30I上海海洋大学硕士学位论文++[M+H-2TCA-2H2O]和704.35[M+H-H2O]；分子离子峰706.30的主要二级碎片为+++354.30[M+H-2TCA]和336.30[M+H-2TCA-H2O]、318.30[M+H-2TCA-2H2O]。通过UPLC-PDA全扫描和NMR对FB1、FB2、FB3制备品进一步定性分析，结果均表明：制备得到FB1、FB2、FB3的是高纯度伏马毒素。最后经过LC-MS/MS外标法对所得伏马毒素的纯度

8、进行测定，证明其纯度分别为98.760±0.12%、99.009±0.08%、98.838±0