sirna作用于vimentin抑制大鼠脊髓伤后胶质瘢痕形成的研究

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1、分类号：R683.2学校代码：10062密级：学号：2012701036博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：siRNA作用于Vimentin抑制大鼠脊髓损伤后胶质瘢痕形成的研究TITLETheInfluenceofGlialScarInducedbyRNAInterferenceExpressionofVimentininSpinalCordInjuryofRats一级学科：临床医学二级学科：外科学骨外科学论文作者：李剑锋指导教师：冯世庆教授天津医科大学研究生院二〇一五年三月分类号：R683.2学校代码：10062密级：学号：201

2、2701036学位类别：科学学位√专业学位学科门类：临床医学博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：siRNA作用于Vimentin抑制大鼠脊髓伤后胶质瘢痕形成的研究TITLETheInfluenceofGlialScarInducedbyRNAInterferenceExpressionofVimentininSpinalCordInjuryofRats一级学科：临床医学二级学科：外科学骨外科学论文作者：李剑锋指导教师：冯世庆教授导师组成员：孔晓红教授、吴虹医师天津医科大学研究生院二〇一五年三月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交

3、的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。

4、本论文属于不保密。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日中文摘要【目的】设计筛选siRNA干扰中间丝波形蛋白（Vimentin）序列，观察siRNA-Vimentin对脊髓损伤后反应性星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白（GlialFibrillaryAcidicProtein，GFAP）和硫酸软骨素蛋白多糖（ChondroitinSulfateProteoglycans，CSPG）表达的影响，分析其对脊髓损伤大鼠后肢运动功能和神经电生理功能恢复的作用，及其对脊髓组织GFAP、CSPG和Vimentin的表达及胶质瘢痕形成

5、的影响。探讨siRNA作用于Vimentin在脊髓损伤后反应性星形胶质细胞增生和胶质瘢痕形成过程中所起的作用。【方法】设计3条Vimentin干扰序列，并利用WesternBlot及RT-PCR筛选出沉默效果相对较好的序列；初生SD乳鼠分离培养皮质星形胶质细胞，并经差速贴壁等方法纯化，GFAP免疫化学荧光鉴定获得星形胶质细胞。将细胞分为正常培养AS组、空载质粒处理阴性对照组和siRNA-Vimentin转染组，进行细胞划痕实验、MTT法测定各组细胞增殖能力，免疫荧光化学染色及RT-PCR验证siRNA作用于Vimentin对脊髓损伤后反应性星形胶质细胞增生及

6、胶质瘢痕形成的影响及GFAP、CSPG和Vimentin之间的相互作用。同时，采用改良Allen垂直打击法制备SD大鼠脊髓胸10（T10）脊髓损伤动物模型，并将实验动物随机分为三组：假手术组（30只）、阴性对照组（30只）和siRNA-Vimentin组（30只），于造模同时假手术组注射DMEM/F12培养基5μl，阴性对照组注射DMEM/F12培养基+空载质粒5μl，siRNA-Vimentin组注射DMEM/F12培养基+siRNA-Vimentin质粒5μl。分别于术后24h、1w、2w、4w、8w和12w进行BBB评分，并于术后24h和12w进行SE

7、P、MEP测定；术后4w取各组脊髓组织进行RT-PCR测定GFAP、CSPGs和Vimentin表达情况；术后12w取各组脊髓组织计算各组胶质瘢痕体积。收集以上各数据进行统计学分析。【结果】设计筛选的3条siRNA干扰序列中，siRNA-Vimentin-1073相对沉默效果最好，转染效率最高为转染后24h，细胞转染效率＞80%；原代分离培养的SD大鼠皮质星形胶质细胞纯化后，经GFAP胞浆免疫荧光染色及DAPI细胞核染色，I随机选取6个视野观察，GFAP阳性细胞百分比约为（96.14±1.03）%；星形胶质细胞划痕实验，siRNA-Vimintin组2d/0

8、d宽度比为（0.74±0.17），数值明显为高（P<