nogo-gmcsf复合核酸疫苗的制备及其对损伤脊髓的免疫治疗研究

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1、分类号：密级：论文编号：学号：50121007503重庆理工大学项士学位论文Nogo-GMCSF复合核酸疫苗的制备及其对损伤脊髓的免疫治疗研究研究生:陈开廷指导教师鲁秀敏副教授学位类型学术学位学科专业微生物与生化药学研究方向基因工程药物培养单位药学与生物工程学院论文完成时间2015年3月25曰论文答辩曰期2015年5月29曰1CategoryNumber：LevelofSecrecy：SerialNumber：StudentNumber：50121007503Master'sDissertationofChongqingUniversityofTechn

2、ologyConstructionofNogo-GMCSFcompositenucleicacidvaccineanditsimmunetherapyresearchonspinalcordinjuryPostgraduate:ChenKaitingSupervisor:ProfessorLuXiuminDegreeCategory：AcademicDegreeSpecialty:MicrobialandBiochemicalPharmacyResearchDirection:GeneticallyengineereddrugTrainingUnit:S

3、choolofPharmacyandBioengineeringThesisDeadline:March25,2015OralDefenseDate:May30,20152英文缩写标注Nogo-GMCSF复合核酸疫苗的制备及其对损伤脊髓的免疫治疗研究摘要脊髓损伤（Spinalcordinjury,SCI）后由于中枢神经系统难以恢复而造成部分或大部分器官功能的缺失，以致出现四肢瘫痪甚至各种器官功能丧失。因此这类疾病的治疗需要高昂的治疗和护理费用，给家庭和社会带来巨大的经济和精神压力。成熟的中枢神经系统经损伤后，中枢神经纤维难以再生且难以进行自我修复，但是外

4、周神经系统的神经纤维损伤之后却能够自我修复并恢复其相应的运动功能，主要因为两种神经系统神经纤维所存在的微环境不同。中枢神经微环境中存在多种髓磷脂相关抑制因子(Myelinassociatedinhibitors,MAIs)，在脊髓损伤早期他们会抑制轴突的再生和后期则促进胶质瘢痕的形成。因此通过改善中枢微环境以达到干预抑制信号传递，促进神经轴突再生，可能是针对脊髓损伤行之有效的治疗方法之一。作为一种重要的MAIs，Nogo蛋白主要通过Nogo-66、Amino-Nogo两个功能域参与下游多种受体介导的轴突再生抑制效应，因此以这两个区域为靶点，阻断抑制信号传

5、递，可能会有效促进神经突的再生和保护神经元生长锥的完整；核酸疫苗作为一种新的免疫治疗策略近年来已被广泛应用于各种疾病的治疗研究，这种技术主要由于成本低，应用前景广等多种优点而受到广泛关注；人粒细胞-巨噬细胞集落因子（Granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，GMCSF）具有增强免疫应答和促进T细胞增殖的能力，是一种重要的佐剂因子。GMCSF还具有神经保护作用，可激活神经干、祖细胞且抑制胶质瘢痕的形成。本实验采用基因工程方法分别克隆Nogo-66、Amino-Nogo和GM-CSF基因片段，构建Nogo-G

6、MCSF复合核酸疫苗。体内观察该免疫治疗策略是否能够有效地产生Nogo蛋白，进而利用机体免疫系统产生Nogo抗体，抑制髓磷脂相关抑制信号的传递。利用行为学、组织学等方法体外观察Nogo-GMCSF核酸疫苗是否有助于中枢轴突再生和动物运动功能的恢复，为脊髓损伤的免疫治疗研究提供实践基础。主要技术路线：1.载体的构建、鉴定及表达检测将PCR扩增的GMCSF、Amino-Nogo及Nogo-66三个目的片段，分别亚克隆至pcDNA3.1(+)质粒中，构建重组真核表达载体pcDNA-GMCSF-NogoN-Nogo66，并进行PCR、酶切及基因测序鉴定。脂质体法

7、将构建的重组质粒转染至中国仓鼠卵巢3重庆理工大学硕士学位论文（ChineseHamsterOvary,CHO）细胞后采用免疫荧光和Western-blot法检测其在哺乳动物细胞中的表达。2.Nogo-GMCSF复合核酸疫苗的制备将重组质粒pcDNA-GMCSF-NogoN-Nogo66转化于E.coliDH5α后，大量扩增并收集无内毒素的高浓度质粒；以脂质体包裹重组质粒，按不同体积比（2:1、1:1、1:2）混匀得到Nogo-GMCSF复合核酸疫苗制剂。用远交群（SpragueDawley,SD）大鼠为实验对象，肌肉注射免疫制备的核酸疫苗，每周免疫一次，

8、持续免疫6w，每周跟踪检测各组核酸疫苗所产生的抗体滴度，以获得最佳免疫制剂。3.