马氏珠母贝珍珠层基质蛋白基因的克隆与功能研究

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1、分类号••Q71密级：公开UDC：577学号：2111201108广i海洋太含硕士学位论文马氏珠母贝珍珠层基质蛋白基因的克隆与功能研究董冰冰指导教师：杜晓东教授串请学位类m：理学硕士专业名称：海洋生物学研究方向：海洋经济动物发育生物学学院名称：水产学院中国•湛江2015年6月学位论文答辩委员会组成主席：委员：导师：时间：广东海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集

2、体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密□，在______年解密后适用本授权书。2、不保密□。√（请在以上相应方框内打“√”）作者签名：年月日导师签名：年月日马氏珠母贝珍珠层基质蛋白基因的克

3、隆与功能研究摘要本文在实验室前期研究基础上，以本课题组马氏珠母贝基质蛋白全谱为基础，并以在珍珠囊和中央膜转录组数据库中高表达为依据，筛选出可能与珍珠层形成相关的6个基因：4个没有功能注释的新基因和2个有丝氨酸蛋白酶抑制剂功能注释的基因。通过RACE和基因克隆技术获得这些基因的全长，对其序列的结构特征进行分析，通过Real-timePCR技术对各个基因进行组织差异表达分析，RNA干扰结合Real-timePCR及扫描电子显微镜（SEM）观察等技术对其在珍珠层形成中的功能进行初步分析，原位杂交技术研究基因的表达定位，进一步采用原核表达技术获得重组蛋白

4、并通过westernblot技术进行验证，为确认珍珠层形成相关的矿化基因与蛋白的对应关系，揭示珍珠层的分子调控机制研究提供依据。1.四个没有功能注释的新基因按已有命名规则分别命名为：精氨酸丰富基质蛋白（Argnine-richmatrixprotein，Pm-RRMP)、甘氨酸丰富基质蛋白（Glycine-richmatrix，Pm-GRMP）、脯氨酸丰富基质蛋白（Proline-richmatrixprotein，Pm-PRMP）、丝氨酸丰富基质蛋白（Serine-richmatrixprotein，Pm-SRMP），cDNA全长分别为1063

5、bp、2088bp、2312bp、3154bp，分别编码273、565、589和958个氨基酸，均为具有信号肽执行胞外功能的分泌蛋白。同样，利用Real-timePCR技术进行基因组织差异表达分析发现除了Pm-RRMP，另外3个基因的mRNA都主要在外套膜中央区及珍珠囊中呈现高表达，可能参与珍珠层的矿化过程，而Pm-RRMP在边缘膜中呈现高表达可能与贝壳棱柱层形成相关。RNA干扰后目的基因在外套膜中央区的表达量显著下降，结合SEM观察贝壳内表面的超微结构发现，珍珠层结构排列不规则，片层之间界限模糊，有融合的趋势，说明这4个基因在贝壳形成过程中起着

6、重要作用。另外原位杂交研究还发现马氏珠母贝Pm-PRMP基因的mRNA表达定位于外套膜的外表皮，进一步证明它与珍珠层形成相关。2.两个有丝氨酸蛋白酶抑制剂功能注释的基因分别命名为Pm-NSPI-1、Pm-NSPI-2，cDNA全长分别为766bp和702bp，分别编码164和183个氨基酸，预测分析均具有信号肽，说明两者均为分泌蛋白。成熟肽中都存在2个串联的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因家族结构域，根据这些特有的序列特征，我们初步确定本实验所克隆的2条序列均为马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制I剂家族成员。利用Real-timePCR

7、技术进行基因的组织差异表达分析发现，这2个基因都主要在外套膜中央区及珍珠囊组织中高表达；RNA干扰后发现目的基因在中央膜的表达量显著下降，SEM观察发现干扰后珍珠层结晶体表面粗糙，排列错乱，六边形结构不明显；运用原位杂交技术进行组织定位，研究发现Pm-NSPI-2基因的mRNA特异性地表达于外套膜的外表皮，这些研究结果均可表明筛选出的有丝氨酸蛋白酶抑制剂功能注释的目的基因均在珍珠层的形成中发挥重要作用。通过构建Pm-NSPI-1和Pm-NSPI-2的原核表达重组质粒，在大肠杆菌中进行优化表达，发现Pm-NSPI-1重组蛋白在IPTG浓度为0.1m

8、M，诱导时间为12h，诱导温度为37℃时为其蛋白诱导的最佳条件；而相应地Pm-NSPI-2在IPTG浓度为0.8mM，诱导时间为8h，诱