马氏珠母贝肿瘤坏死因子受体及其相关因子基因的克隆与功能研究.pdf

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1、分类号：S917.4密级：UDC：639.4学号：2111501022硕士学位论文马氏珠母贝肿瘤坏死因子受体及其相关因子基因的克隆与功能研究吴羽媛指导教师：梁海鹰教授申请学位类别：农学硕士专业名称：水产养殖研究方向：水产无脊椎动物增养殖及珍珠培育学院名称：水产学院中国·湛江2018年6月马氏珠母贝肿瘤坏死因子受体及其相关因子基因的克隆与功能研究摘要肿瘤坏死因子受体（tumornecrosisfactorreceptor,TNFR）通过肿瘤坏死因子受体相关因子（tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactors,TRAF

2、）等信号分子介导信号传导通路参与宿主免疫防御，炎症，环境应激等生物过程。为了进一步研究其免疫功能，本研究基于转录组数据，筛选出马氏珠母贝肿瘤坏死因子受体及其相关因子关健基因，并进行基因克隆、组织定量、免疫刺激、基因沉默后的表达分析，并通过原核表达技术获得重组蛋白。主要研究结果如下：（1）马氏珠母贝TNFR和TRAF基因的克隆与定量分析：本研究成功克隆得到PmTNFR1、PmTNFR2、PmTNFR5(CD40)、PmTRAF2和PmTRAF4的cDNA全长序列，分别编码406、427、533、527和470个氨基酸。通过序列分析发现PmTNFR1、PmTNF

3、R5分别存在两个和三个TNFR家族半胱胺酸丰富结构域，一个跨膜结构域和一个死亡结构域；PmTNFR2存在两个TNFR域和一个跨膜域；PmTRAF2存在一个RING指结构域、两个锌指结构域、一个Coiled-coil结构、一个cIAP2结合位点和一个TRAF结构域，PmTRAF4存在三个锌指结构域和一个TRAF结构域。组织定量结果显示5个基因在免疫组织鳃和肝胰腺中表达量显著高于其它检测组织。（2）脂多糖（LPS）刺激、植核移植刺激条件下，5个基因在血淋巴中的表达谱：LPS刺激后，PmTNFR1和PmTNFR5基因的表达量在48h显著上调，PmTNFR2基因的表

4、达量在6h和48h显著上调；PmTRAF2基因的表达量在6h和48h显著上调，PmTRAF4基因在6h显著高表达。植核后的不同时期，PmTNFR1和PmTNFR2基因的表达量在15d显著上调，PmTNFR5在5d和15d表达量显著上调；PmTRAF2基因的表达量在5d、15d和30d显著上调，PmTRAF4表达水平没有显著性差异。结果表明了这5个基因参与了马氏珠母贝免疫应答反应。（3）免疫刺激后NF-κB信号通路关健信号分子的表达分析：运用Real-timePCR检测了LPS刺激和植核移植后信号分子LITAF、TRADD、TRAF2、NIK、IKK和NF-κ

5、B的表达情况。已知PmTNFR1、PmTNFR2和PmTNFR5在LPS刺激后的48h显著上调，在植核后的第15d表达量上调。分析数据发现这些信号分子的表达量的表达模式与PmTNFR1、PmTNFR2和PmTNFR5相似。说明PmTNFR1、PmTNFR2和PmTNFR5可能介导的NF-κB通路参与机体的免疫应I答反应。（4）RNAi技术研究信号通路：运用Real-timePCR检测PmTNFR1和PmTNFR5基因沉默后自身及其下游信号分子的表达情况。结果显示：PmTNFR1在第4d表达量显著下调，且下游基因TRADD、Caspase-8、Caspase-

6、3、TRAF2、NIK、IΚΚ和NF-κB具有相同的抑制表达模式；PmTNFR5在第1d表达量显著下调，检测其下游基因TRAF2、NIK、IΚΚ和NF-κB具有相同的抑制表达模式。推测马氏珠母贝通过TNFR1介导的细胞凋亡通路和NF-κB信号通路，以及TNFR5介导的NF-κB信号通路参与调控机体的免疫反应。（5）成功构建了pET-15b-PmTNFR5和pET-15b-PmTRAF2原核表达载体，并经过诱导和纯化成功获得重组蛋白。关键词：肿瘤坏死因子受体；肿瘤坏死因子受体相关因子；脂多糖；植核移植；RNAi技术IIThecloningandfunction

7、alstudyoftumornecrosisfactorreceptorandtheirassociatedfactorsgenesofPinctadafucatamartensiiAbstractTumornecrosisfactorreceptormediatessignaltransductionpathwaysthroughsignalingmoleculessuchastumornecrosisfactorreceptor-associatedfactorsinvolvedinhostimmunedefense,inflammation,anden

8、vironmentalstressbiologica