间隙连接蛋白43表达下调对血管内皮细胞和炎症反应的作用

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1、学校代码：10385分类号：研究生学号：1200216023密级：间隙连接蛋白43表达下调对血管内皮细胞和炎症反应的作用Theeffectsofconnexin43downregulationonvascularendothelialcellsandinflammatoryresponse作者姓名：张才臻指导教师：刁勇教授合作教师：学科：生物化学与分子生物学研究方向：基因治疗所在学院：生物医学学院论文提交日期：二零一五年六月十日学位论文独创性声明本人声明兹呈交的学位论文是本人在导师指导下完成的研究成果。论文写作中不包含其他人已经发表或撰写过的研究内容，如参

2、考他人或集体的科研成果，均在论文中以明确的方式说明。本人依法享有和承担由此论文所产生的权利和责任。论文作者签名：签名日期：学位论文版权使用授权声明本人同意授权华侨大学有权保留并向国家机关或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅。本人授权华侨大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。论文作者签名：指导教师签名：签名日期：签名日期：摘要摘要近年来研究发现，间隙连接蛋白43（connexin43，Cx43）的表达与皮肤伤口愈合关系密切。皮肤创伤后，伤口内部及其周围组

3、织中Cx43的表达瞬时下调，可以加快皮肤伤口愈合的速率，提高伤口愈合的质量。参与皮肤伤口修复的细胞主要有三种：成纤维细胞、角质形成细胞和血管内皮细胞。有关Cx43与伤口愈合分子机制的研究表明：Cx43表达下调可以加快成纤维细胞、角质形成细胞的迁移速率，提高成纤维细胞和角化形成细胞增殖能力及角化细胞的分化能力。但Cx43是否影响血管内皮细胞的功能尚不清楚。已知血管内皮细胞会参与皮肤伤口愈合的整个过程。在炎症阶段，白细胞需要渗漏穿过毛细血管内皮层，到达创伤部位引发炎症反应。而在增殖阶段，血管内皮细胞是伤口处血管新生的主要细胞，新生血管可以为伤口区域细胞的迁移、

4、增殖提供氧气和营养物质。基于血管内皮细胞对伤口愈合的重要性，本文研究分析Cx43下调对于血管内皮细胞功能的影响。人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）是最常用的血管内皮细胞模型，而且它对包括炎症因子在内的多种体内因子均具有良好的反应性。因此，本文选择HUVECs作为体外研究模型。小干扰RNA（siRNA）能够特异性减少蛋白在细胞中的表达。根据Cx43基因序列，本课题组设计了三种siRNA序列（Cx43siRNA1，Cx43siRNA2，Cx43siRNA3）。通过Westernblot实验筛选沉默效果最佳的siRNA序列及siRNA最佳作用时间，结果表明si

5、RNA作用HUVECs24h后，Cx43沉默效率达到最大，并有效维持最佳沉默效果达72h以上。三种序列中，Cx43siRNA1沉默效果最佳，作用24h时，即可使HUVECs内Cx43的表达降低约80%。因此，本课题选择Cx43siRNA1作为特异性减少Cx43的siRNA序列，作用24h作为最佳作用时间，研究Cx43的表达下调对HUVECs细胞间通讯、增殖、迁移、以及血管生成活性的影响。实验结果表明HUVECs中Cx43蛋白表达下调后，HUVECs细胞间信号传递功能减少约65%，细胞活力、增殖和迁移活性显著降低、血管生成速度减缓。炎症阶段是影响创伤愈合速率

6、和质量的重要阶段。炎症反应的发生需要经历白细胞贴壁、粘附、穿越血管内皮细胞层的过程。白细胞与内皮细胞之间的I华侨大学硕士学位论文粘着及白细胞渗出内皮细胞层是炎症反应的必经阶段。因此，本课题继续研究HUVECs中Cx43下调，对单核细胞U937与HUVEC之间粘着，以及U937穿过HUVECs细胞层能力的影响。肿瘤坏死因子α（TNF-α）可以刺激HUVECs呈现炎症状态，因此，本文使用TNF-α刺激HUVECs，以模拟体内炎症状态。Calcein-AM标记U937法及活细胞虎红染色法实验结果表明，TNF-α刺激HUVECs后，HUVECs对U937的粘附能力

7、增加，HUVECs确实能够达到炎症状态。HUVECs中Cx43蛋白下调后，U937与HUVEC之间的粘附能力明显降低。filterinserts实验结果表明U937迁移穿过HUVECs细胞层的数目减少。本课题进一步进行分子机制研究。已知粘着分子在白细胞与内皮细胞的粘附过程中起到至关重要的重要，本研究通过Westernblot及rt-PCR分析HUVECs中Cx43下调对粘着分子表达的影响，发现Cx43蛋白下调后，HUVECs中粘附分子细胞间粘附分子（ICAM-1）、血管粘附分子（VCAM-1）表达下调，而CD44表达基本没有变化。以上的研究表明，伤口处Cx

8、43表达下调，会通过影响血管内皮细胞生物学特性，包括降低细胞间隙连