血红素氧化酶1对脂肪间充质干细胞增殖、凋亡、成骨活性和募集能力的影响

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1、分类号：R68学校代码：10062密级：学号：2012602622硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：血红素氧化酶1对脂肪间充质干细胞增殖、凋亡、成骨活性和募集能力的影响TITLETheeffectofproliferation,apoptosis,osteogenicdifferentiationandrecruitmentofADSCstransducedbyhemeoxygenase1一级学科：临床医学二级学科：外科学骨外论文作者：陈晓鹏指导教师：胡永成教授天津医科大学研究生院二零一五年五月分

2、类号：R68学校代码：10062密级：学号：2012602622学位类别：科学学位专业学位学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：血红素氧化酶1对脂肪间充质干细胞增殖、凋亡、成骨活性和募集能力的影响TITLETheeffectofproliferation、apoptosis、osteogenicdifferentiationandrecruitmentofADSCstransducedbyhemeoxygenase1一级学科：临床医学二级学科：外科学骨外论文作者：陈晓鹏指导教师：胡永

3、成教授导师组成员：张荣信教授天津医科大学研究生院二零一五年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：2015年05月20日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行

4、检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密√。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：2015年05月20日导师签名：日期：2015年05月20日天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：从大鼠腹股沟脂肪中提取培养脂肪基质干细胞（Adipose-derivedstromalcells,ADSCs），鉴定其生物学特性；构建高表达血红素氧化酶1（Hemeoxygenase1,HO-1）的慢病毒表达

5、载体，包装病毒后转染ADSCs，建立ADSCs-HO-1模型；体外研究HO-1修饰的ADSCs对其自身增值、凋亡和成骨分化的影响，以及对周围细胞的募集作用，并探讨其在骨组织工程中的应用策略。方法：1.胶原酶消化脂肪获取细胞后，采用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离培养ADSCs，接种于培养基中进行培养传代。通过观测其形态特点、流式细胞技术鉴定其表面标志和多功能分化潜能（成脂分化和成骨分化）鉴定培养细胞为脂肪基质干细胞；2.从携带有目的基因HO-1的载体Puc57上克隆目的基因序列，通过酶切、酶连，将其连入慢病毒表达载体pZsG中

6、，再将连接成功的表达载体转化感受态大肠杆菌DH5α，经菌落PCR鉴定连接结果，扩增提取该表达载体。将携带目的基因的慢病毒表达载体与另外三个慢病毒包装载体在293T细胞中包装，分别于48h和72h收集慢病毒液。在8μg/ml的转染试剂Polybrene条件下转染ADSCs，建立ADSCs-HO-1模型，westernblot验证转染结果；3.将细胞分为四组：ADSCs转导HO-1组（A组）、ADSCs转导空载体组（B组）、ADSCs未转导组（C组）和ADSCs转导HO-1组加锡-原卟啉(Sn-protoporphyrin,Sn

7、PP)（D组）。采用MTT、流式细胞仪分析凋亡率探讨HO-1修饰的ADSCs对其自身增值、凋亡和成骨分化的影响；通过qRT-PCR检测骨标志物和钙基质染色分析HO-1修饰的ADSCs对其自身成骨分化情况；划痕实验和transwell观察HO-1高表达对ADSCs募集作用的影响。结果：1.体外成功分离培养出大鼠ADSCs，形态呈长梭形，具有成骨、成脂分化潜能，经鉴定第2代贴壁细胞阳性表达CD29（99.3%）、CD44（70.7%）、CD90（52.0%），阴性表达CD45（3.73%）和CD31（6.58%）；2.构建高表达

8、HO-1的慢病毒表达载体pZsG-HO-1，菌落PCR证实HO-1片段连入表达载体，包装慢病毒后转染ADSCs，westernblot检测HO-1蛋白在ADSCs中高表达；3.①MTT连续1周检测A和B组细胞活性，第2天测定A组较B组活性增高，I天津医科大学硕士学位论文差异有统计学意义（p