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硕士学位论文纤维素降解混合菌剂的构建及降解效能CONSTRUCTIONOFCELLULOSE-DEGRADINGCOMPOUNDMICROBIALINOCULUMANDDEGRADATIONEFFICIENCY夏强哈尔滨工业大学2018年06月 国内图书分类号：Q939.97学校代码：10213国际图书分类号：579密级：公开理学硕士学位论文纤维素降解混合菌剂的构建及降解效能硕士研究生：夏强导师：宋金柱教授申请学位：理学硕士学科：生物学所在单位：生命科学与技术学院答辩日期：2018年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学 ClassifiedIndex:Q939.97U.D.C:579DissertationfortheMasterDegreeinScienceCONSTRUCTIONOFCELLULOSE-DEGRADINGCOMPOUNDMICROBIALINOCULUMANDDEGRADATIONEFFICIENCYCandidate:QiangXiaSupervisor:Prof.JinzhuSongAcademicDegreeAppliedfor:MasterofScienceSpeciality:BiologyAffiliation：SchoolofLifeScienceandTechnologyDateofDefence:June,2018Degree-Conferring-Institution:HarbinInstituteofTechnology 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文摘要纤维素作为储量最丰富的有机生物质，其资源化过程受到广泛关注。研究其科学合理的利用方式既能够实现能量的循环利用，又能得到高附加值产品。目前植物性纤维素的主要利用方式多为物理粉碎或化学焚烧，造成了资源浪费，对环境产生了诸多不利影响。本研究从实验室现有的菌株中筛选出具有纤维素降解能力的微生物，并成功构建了混合菌剂，对纤维素的生物降解利用和环境保护具有积极意义。本文通过刚果红染色实验和FPA酶活测定，筛选出了具有纤维素降解能力的黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌，在充分考虑菌株之间的共生和互补因素后，成功构建了混合菌剂。经验证，混合菌剂的纤维素各组分酶酶活均高于单一菌株，FPA酶活可达到3.65U/mL。通过单因素试验，选择温度、初始pH、盐度、摇床转速和接种量5个因素对混合菌剂的产酶条件进行了优化，确定最优产酶条件为：温度32℃、初始pH=8.0、盐度1%、摇床转速160rpm、接种量1%。通过正交试验方法，对混合菌剂的菌种配比进行了优化，得到最优配比为黑曲霉：绿色木霉：地衣芽孢杆菌=3:3:2，最大FPA酶活可达到7.01U/mL，是优化前的1.9倍。选择水稻、玉米和小麦3种不同农作物的秸秆为底物，利用范式洗涤法研究了降解前后不同秸秆各组分含量的变化，探明混合菌剂对不同秸秆的降解效能。本研究为农业废弃秸秆纤维素的资源化利用拓宽了渠道，对纤维素降解的工业化具有积极影响。关键词：纤维素降解；混合菌剂；菌种配比；降解率-I- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文AbstractCellulose,asthemostabundantorganicbiomass,iswidelyconcernedaboutitsresourcetransformation.Researchingitsscientificandrationalutilizationmethodscannotonlyrealizetherecyclingofenergy,butalsoobtainhighvalue-addedproducts.Atpresent,themainutilizationmethodsofvegetalcellulosearemostlyphysicalcomminutionorchemicalincineration,resultinginwasteofresourcesandcausingmanyadverseeffectsontheenvironment.Inthisstudy,microorganismswithcellulosedegradationabilitywerescreenedfromtheexistingstrainsinthelaboratory,andacompoundinoculumwassuccessfullyconstructed,whichhaspositivesignificanceforthebiodegradationandutilizationofcelluloseandenvironmentalprotection.Inthispaper,Aspergillusniger,Trichodermaviride,andBacilluslicheniformiswithcellulosedegradationabilitywerescreenedbyCongoredstainingassayandFPAenzymeactivityassay.Afterfullyconsideringthesymbioticandcomplementaryfactorsbetweenthestrains,thecomplexinoculumweresuccessfullyconstructed.Itwasprovedthatcellulaseactivityofcompoundinoculumgroupwashigherthanthatofsinglestrain,andFPAenzymeactivitycouldreach3.65U/mL.Throughthesinglefactortest,theoptimumconditionsforenzymeproductionwereasfollows:temperature,initialpH,salinity,shakingspeed,andinoculumsize.Theoptimalenzymeproductionconditionswereasfollows:temperature32°C,initialpH=8.0,salinity1%,shakerspeed160rpm,inoculationamount1%.Orthogonaltestmethodwasusedtooptimizetheratioofstrainsofthecompoundinoculum.TheoptimumratiowasAspergillusniger:Trichodermaviride:Bacilluslicheniformis=3:3:2,andthemaximumFPAactivitywas7.01U/mLis1.9timesbeforeoptimization.Thestrawofthreedifferentcropsofrice,cornandwheatwasselectedasthesubstrate.Thechangesofthecontentsofdifferentstrawcomponentsbeforeandafterdegradationwerestudiedusingtheparadigm-washingmethod,andthedegradationefficiencyofthedifferentmicrobialbacteriumwasdetermined.Thisstudyhasbroadenedthechannelsfortheutilizationofagriculturalwastestrawcelluloseandhasapositiveimpactontheindustrializationofcellulosedegradation.Keywords：Cellulosedegradation,Complexflora,Strainratio,Degradationrate-II- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文目录摘要..........................................................................................................................IAbstract.......................................................................................................................II第1章绪论............................................................................................................11.1课题来源.........................................................................................................11.2研究背景及目的意义.....................................................................................11.2.1研究背景...................................................................................................11.2.2研究的目的及意义...................................................................................21.3纤维素和纤维素酶概况.................................................................................41.3.1纤维素的结构与降解特性.......................................................................41.3.2纤维素酶的特性及研究概况...................................................................51.4纤维素降解混合菌剂的研究概况.................................................................91.4.1影响纤维素混合菌剂构建的因素...........................................................91.4.2混合菌剂的构建.....................................................................................101.4.3国内外纤维素降解菌（群）研究进展.................................................111.5主要研究内容及技术路线...........................................................................12第2章实验材料与方法..........................................................................................142.1实验材料.......................................................................................................142.1.1试验菌种及来源.....................................................................................142.1.2所用培养基种类及配方.........................................................................142.1.3实验药品及试剂.....................................................................................162.1.4实验仪器及设备.....................................................................................182.2实验方法.......................................................................................................182.2.1受试菌种的活化及筛选.........................................................................182.2.2不同菌株之间的拮抗实验.....................................................................192.2.3生长曲线的测定.....................................................................................202.2.4DNS法测定纤维素酶活.........................................................................212.2.5单因素优化实验.....................................................................................222.2.6菌种配比的正交优化.............................................................................232.2.7范式洗涤法测纤维素成份.....................................................................24第3章纤维素降解菌的筛选及混合菌剂的构建..................................................263.1菌株的筛选....................................................................................................26-III- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文3.1.1定性筛选.................................................................................................263.1.2定量筛选.................................................................................................273.2纤维素降解菌剂的构建...............................................................................283.2.1目标菌株之间的拮抗性实验.................................................................293.2.2目标菌株的酶系互补实验.....................................................................293.2.3各菌种生长曲线的测定.........................................................................323.3混合菌剂产酶能力测定...............................................................................343.3.1纤维素内切酶酶活的比较.....................................................................343.3.2纤维素外切酶酶活的比较.....................................................................353.3.3β-糖苷酶酶活的比较...............................................................................353.3.4纤维素总酶活的比较.............................................................................363.4讨论...............................................................................................................373.5本章小结.......................................................................................................37第4章混合菌剂的优化..........................................................................................394.1混合菌剂产酶条件的单因素优化...............................................................394.1.1温度的优化.............................................................................................394.1.2初始pH的优化......................................................................................404.1.3盐度的优化.............................................................................................404.1.4摇床转速的优化.....................................................................................414.1.5接种量的优化.........................................................................................424.2混合菌剂菌种配比的正交优化...................................................................424.3讨论...............................................................................................................444.4本章小结.......................................................................................................45第5章混合菌剂对不同底物降解效能的初步探究..............................................465.1混合菌剂对水稻秸秆降解效能的研究.......................................................465.2混合菌剂对玉米秸秆降解效能的研究.......................................................475.3混合菌剂对小麦秸秆降解效能的探究.......................................................485.4讨论...............................................................................................................495.5本章小结.......................................................................................................50结论........................................................................................................................51参考文献....................................................................................................................53哈尔滨工业大学学位论文原创性声明和使用权限................................................61致谢........................................................................................................................62-IV- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文第1章绪论1.1课题来源国家科技支撑项目：村镇生活垃圾清洁能源利用共性技术与设备研发，项目编号：2014BAL02B02。1.2研究背景及目的意义纤维素是一种大分子生物质，我们通过科学合理的方式能够实现能量的循环利用，并得到高附加值产品。所以我们研究纤维素降解对其利用具有重要意义。纤维素是由葡萄糖残基通过β-1.4-糖苷键连接而成的线性多糖，是植物合成的主要碳水化合物，植物每年通过光合作用固定的碳约有将近50%以纤维素形式储藏。与传统化石燃料相比，纤维素材料可以被视为丰富的廉价可再生资源。以实用为目的的纤维素分解微生物主体或纤维素分解酶的研究（例如生物燃料）已经引起生物学家的广泛关注。据估计，全球每年将通过光合作用生产超过千亿吨，其中89％未被使用。对我们国家来说，每年可用的纤维素材料可以算在20亿吨以上。如何有效利用它，就在于如何将其发酵转化为糖。特别是，筛选有效的纤维素降解微生物[1]是研究热点。1.2.1研究背景[2]植物性纤维素是全球储量最丰富的可再生资源，每年由绿色植物固定的碳大[3]部分都以纤维素和半纤维素形式存贮，分别可达到720和600亿吨。我国是农业大国，同时也是农业秸秆纤维素产出的大国，每年会有超过45亿吨的动物排泄物[4]和农业生产垃圾。令人堪忧的是，90%以上的纤维素生物质都没有得到合理有效的利用，更多得是通过传统的堆肥或者焚烧方式处理，一方面浪费了这些潜在的可再生生物能源，另一方面也对环境造成了一定的负面影响。现在摆在我们面前的问题就是怎样建立起一个高效、节能、环保的方式，使纤维素生物质得到充分有效的利用。这其中问题的关键就是通过生物手段实现植物性纤维素的循环利用，目前已[5]受到很多研究人员的关注，并取得了一些可喜的结果。其中以里氏木霉(Trichodermareesei)的研究最为深入，且已在纤维素降解的工业生产中得到最广泛-1- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文[9][7]的应用，现已通过系统的生物学研究方法揭示了里氏木霉合成纤维素酶的机理。虽然降解木质纤维素微生物分离和相关降解酶的研究已取得了重大的进展，相比于生物降解的开发周期长、投入成本高、工艺优化难的特点，更多的农业植物性纤[10]维素是以堆肥的方式处理的，这种方式仍存在着很大的局限性。在已有的研究中表明，研究人员将纤维素降解的视线转移到了微生物上，开发出了大量的纤维素降解菌剂。然而，受到单一菌种产酶条件要求高、降解效果不理想、降解底物较单一等特点的制约，越来越多的人选择构建混合菌剂用于降解纤维素。在这方面，王[11-13]海滨、孙一博、张二红等人筛选了高效降解纤维素的菌剂，并分别对各自的混合菌剂进行了产酶条件优化、降解效能分析以及菌剂特性相关方面的研究，为本实验提供了参考依据。基于传统纤维素处理方式的弊端，以及纤维素降解混合菌剂的研究现状，为构建新的纤维素降解混合菌剂，丰富天然纤维素高效降解的基础数据，特开展本研究。1.2.2研究的目的及意义如何将纤维素这类可再生的绿色能源真正转变成可以利用的资源正吸引越来越多研究人员的目光。在研究过程中人们发现，微生物在纤维素降解过程中有着天然的优势，通过合理的选择不同的微生物，在将纤维素资源化的过程中几乎对环境[14]没有负面影响。正因如此，微生物降解纤维素受到越来越多的关注。为探明纤维素是如何被分解成为小分子多糖的过程，国内外研究人员做了相当多工作，取得了一些成绩。在纤维素工业化生物降解过程中，筛选高效微生物降解纤维素以及利用菌株之间的功能互补降解纤维素的研究是其中关键。区别于传统方法，纤维素的生物降解需要探明机理，要针对不同底物的需求筛选分离不同的菌种，对菌株和酶之间的协同作用和互补机理进一步探究，同时要分析每种纤维素降解菌在纤维素降[15]解中发挥的作用，并以此为基础保证混合菌系的稳定性和高效性。传统的纤维素预处理技术主要包括物理方法、化学方法、物理化学法以及生物处理法和联合法。其中物理方法中的固体破碎法对降解效能的作用不大，同时兼有[16]能耗大、成本高等缺点，适用范围比较小；微波处理虽然用时少、难度低、污染[17]少、能耗低，但是对设备要求较高，与实际的工业生产要求不符；李松晔等人在报道中提到：用超声技术处理植物性纤维素，可以破坏纤维素大分子中的氢键，使纤维结晶结构破坏，降低聚合度；但是同时也会降解部分半纤维素，使纤维素成分[18]的比例受到影响，降低了纤维素的降解率。对于化学方法来说，酸碱处理对木质素的含量和结构基本无影响，同时会残留并产生一些不利于纤维素降解的物质，若-2- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文[19][20]要降低或消除这种不利因素，需要增加额外的工艺流程，增加了生产成本；碱处理在受到更大制约，不仅后续降解效率较低，同时会对环境产生不利影响，处[21]理后的污水和残渣的回收也需要额外能耗，工业降解纤维素一般不采用此法；纤维素的有机溶剂处理对操作要求高，同时会抑制纤维素的后续降解；离子液体处理方式需要经过复杂的制造过程，提高了降解成本，同时自身黏度大，流动性较差，[22]无法保证一定时间跨度内系统的安全稳定，不适合目前的工业生产；汪丹妤等研究表明：臭氧作用麦草浆后，木质素被降解形成可溶性糖，纤维素基本不变，在这过程中要使用H2O2、O3和O2等多种氧化剂，导致处理成本高。相比于物理化学处理方法，纤维素的生物处理因其能耗低、无污染、作用条件温和等优点，现已发展成为纤维素降解的主要研究方向。天然存在的植物性纤维素材料一般由木质素、纤维素和半纤维素构成，各种微生物对天然纤维素的降解效能也参差不齐，受到纤维素酶系的影响，有的菌株可以[23]降解不同组分，也有只参与某一种组分甚至某一个反应的菌株。因此，虽然降解纤维素的高效菌株不断增多，仍然受到各方面的制约，无法保持较高的纤维素降解[24]效率。若纤维素不经过前期处理，单一菌株很难破坏纤维素的结晶区域，降解效率极低。因此，混合菌剂为研究人员提供了新的思路，可以综合不同菌株的优势，大幅度提高对纤维素的利用效率，为纤维素作为可再生资源的循环利用有重要意义。由于产酶条件、降解效率、经济价值等方面的制约，在目前的研究中已经构建的混合菌剂多为真菌共作，兼有少量放线菌和细菌。目前，对于微生物降解纤维素的方式有两种解释方法，一种是外部破坏，然后内部降解;另一种是从内向外的侵蚀。大多数真菌降解纤维素的研究表明，菌丝穿过次生壁进入，并且从内部继续生长以降解纤维素，逐渐破坏纤维结构，以达到降解纤维素的效果。对于细菌来说，它会附着在纤维素纤维上，然后从表面生长到纤维素结构的内部。纤维素与菌株的接触点会降解，纤维表面呈锯齿状腐蚀。这些微生物会产生合成的胞外纤维素，并[25]产生少量合成结晶纤维素萤光素酶簇的微生物降解。目前研究最多的纤维素降[26]解菌是霉菌，具有强酶活性的微生物是木霉属、曲霉属、根霉属和青霉属。纤维素由于结构的特点，使得一步降解的难度很大。目前来看，纤维素的降解大抵分为两个过程，一是大分子纤维素转化为相对分子较小的多糖的过程，称之为糖化过程；二是微生物降解多糖产生单糖或者形成菌体蛋白的过程，称之为发酵。近年来利用混合菌培养作了一些研究,结果令人满意。在纤维素生物降解中应用混合菌培养技术,既可以提高对纤维素的降解率,又能使一些对纯培养菌的降解作用呈现抗性的成分发生降解,还能一步处理生物质,而不必像纯培养需进行多步处理,-3- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文[27]提高了效率，减少了对环境的污染和生物质的利用率。由此本研究拟利用实验室现有的菌株，经过筛选后，通过混合培养技术构建纤维素降解混合菌剂，并对其产酶条件和菌种配比进行优化，最终以水稻秸秆、玉米秸秆和小麦秸秆等富含纤维素的生物质为底物，初步探究所构建菌剂的降解能力。1.3纤维素和纤维素酶概况1.3.1纤维素的结构与降解特性纤维素广泛存在于自然界中，它作为植物结构的多糖骨架，广泛的存在于自[28-29]然界各类植物机体中，其中大多是以木质纤维素的形式储存的。全世界每年通过光合作用产出的木质纤维素早已突破2000亿吨大关，成为地球上存储量最大的可再生资源之一。它主要由半纤维素、木质素和纤维素组成。纤维素主要由碳、氢、氧三种元素共同组成的，含碳量约为44%，含氢量约为6%，含氧量约为49%，纤维素分子是由吡喃型D-葡萄糖残基以β-1,4-糖昔键相连接而构成的具有复杂结构的结晶分子。第6碳原子与糖基结构相互结合，形成束带状的纤维单元。另外，在不同的纤维链之间形成了大量的氢键，极大的提高了纤维素结构的稳定性。纤维素在结构上差异很大，纤维素直链分子的折叠形式、氢键位置的不同，形成了众多不同的高度结晶的单元，这些纤维单元在氢键的作用下形成束状结构，一般情况下会根据密度的大小形成不同的区域，密度大的区域结构整齐，成为稳定的结晶区域；而密度小的地方分子间作用力较小，分子排列散乱，成[30]为无定形区域。从纤维素总体结构来看，原纤丝之间排列规则，互相之间结合紧[31-33]密，构成了结晶纤维结构，是植物细胞壁的主要成分。其化学分子式为（C6H10O5）n，其中n为葡萄糖残基的个数，我们也称之为聚合度（DP），在不同种类的植物纤维中，DP的数值往往差距很大。我们可以通过DP的值来确定纤维素分子的大小。商用纤维素的DP一般聚合度比较低，约为50～5000不等，微生物纤维的DP一般在3500左右，植物纤维的DP相对较大，可以达到14000以上。由于纤维素含有大量的糖原使得它可以作为众多加工业的原料，但是目前纤维的利用现状并不理想。纤维素是链状的高分子化合物，理化性质相对稳定，在常温下不溶于水、稀酸和稀碱。再经过处理之后，才可将DP降低，直至完全水解，最终得到葡萄糖产物。在纤维素的分子结构中，不仅在纤维素链内部存在着氢键，在纤维素链之间也存在大量的氢键，使得纤维素的聚合结构很难被破坏，这就给纤-4- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文维素的降解带来了相当大的阻力。在各类农作物秸秆中，木质素和半纤维素将纤维素包裹其中，在木质素的包裹下，纤维素与半纤维素紧密集合，使得纤维素的降解速度和最终葡萄糖产量均收到了不利影响。正是由于纤维素分子机构的稳定性，导致了通常含有大量纤维素的废弃物都是以燃烧、掩埋的方式处理掉，这就造成了全[34-35]球的资源浪费，同时由此引发的环境污染和资源浪费已经逐渐引起人们的重视。在自然条件下，纤维素中通过缔合氢键形成致密结构，同时其外包裹半纤维素[36-37]和木质素很难降解。导致纤维素难降解的因素主要有三点：一是纤维素的结晶结构和聚合程度。纤维素作为天然大分子物质有着较强的稳定性，正是这种稳定性大大影响了纤维素的降解，研究表明，纤维素的结晶度越高，就越难利用，一般只[38]有反刍动物可以直接利用天然纤维素。二是纤维素酶与纤维素接触的难易程度[39-41][39]。Ghose等研究发现，木质素在纤维素降解过程中发挥着保护者的作用，它能有效的降低纤维素酶与纤维素和半纤维素链的接触机会，使得酶与地物无法有效解除，难以发挥作用，同时，木质素的含量越高，对酶分子进入固体基质的阻力[42]越到；SchwarzWH等的研究中，将热纤梭菌的多纤维素酶体（cellulosome）与底物充分接触，使得酶体有了较高的水解效率，证明了纤维素酶必须与底物充分接触才能有效发挥降解功效。三是，来自水解产物的负反馈抑制。随着降解过程的进行，水解产物积累到一定浓度后会抑制纤维素酶的水解效率。1.3.2纤维素酶的特性及研究概况纤维素酶并不是一种单一的酶，而是由3种相互协作的酶系的总称，目前的研究表明，纤维素酶是由包括内切型葡聚糖苷酶、外切型葡萄糖苷酶和纤维二糖酶。其中，内切型葡聚糖苷酶根据来源不同也被叫做Cx酶或CMC酶，它能够随机的对纤维素内部非结晶区域进行分解，但是对产物末端反应相对不敏感，其产物包括纤维糊精、纤维多糖。外切型葡萄糖苷酶也称纤维二糖水解酶或微晶纤维素酶，能够弥补内切葡聚糖苷酶的功能，它主要针对底物的还原或者非还原末端起作用，将糖苷键切段后形成可溶性纤维糊精和纤维二糖，在天然纤维素整个降解通路上起主要作用。纤维二糖酶也称β-葡萄糖苷酶，简称BG，能水解纤维二糖和短链的纤[43]维寡糖生成葡萄糖。1.3.2.1纤维素酶的分子结构及理化性质-5- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文构成纤维素酶的3种酶系基本都含有相似的蛋白质低级结构，不同酶的高级结构因纤维素酶的来源各有差异。纤维素酶的一级结构主要由球形的催化结构域(Catalytiedomains,CD)、纤维素结合结构域(Cellulose-BindingDomsins,CBD)和连接桥(Linker)构成。其中里氏木霉的纤维素外切葡聚糖酶的二级结构是“蝌蚪状”，催化结构域和结合结构域分别位于蝌蚪的头部与尾部，对于纤维素降解起到关键作用的催化结构域占到整个酶分子量的70%左右，而位于尾部的结合结构域的作用在于稳定纤维素酶的整体结构，协同催化结构域完成降解纤维素过程。它们之间通过连接桥连接，目前对于连接桥的作用并没有明确的说法，可能的作用是保持分子间距，或者为满足高级结构的需求。这里可以明确的事，CBD负责将酶体与纤维素的接触，同时将大分子纤维素消化成葡萄糖单链，尔后CD将链状葡萄糖降解[44]为单糖。研究表明，部分纤维素酶与纤维素分子之间的结合是由纤维小体来完[45]成，以纤维小体的形式弥补自身结构中无CBD的缺陷。纤维素酶的主要来自于能够降解纤维素的微生物，包括细菌、真菌和放线菌。在一些反刍动物的瘤胃和肠道内大量的厌氧微生物也具有产纤维素酶的功能。同时在白蚁等昆虫的肠道内也可以产生纤维素酶。研究人员对这些不同的纤维素酶进行了研究发现，这些纤维素酶的结构和性质差别迥异，形成了特点不一的纤维素[46-49]酶体系。从现有的研究总来看，这些纤维素酶的分子量一般在几十kDa到几百kDa之间不等。其中分子量最小的为葡萄糖内切酶，大多数不到50kDa，一般在23kDa—146kDa之间。葡萄糖外切酶分子量稍大，在50kDa—118kDa之间。β-葡萄糖苷酶[50]分子量最大，一般不低于90kDa，甚至可以达到几百kDa。纤维素酶的等电点受到的影响因素较多，真菌产生的内切酶在5.0左右，外切酶稍低，为4.5左右，而β-葡萄糖苷酶的等电点在8.0左右。真菌产生的纤维素酶一般最适pH在3.0—6.0[51]之间，当然也有研究发现，真菌也可以产生碱性纤维素酶。细菌和放线菌产生的纤维素酶多为胞内酶，一般呈碱性，也正因为这一优势，促使研究人员对碱性纤维素酶在造纸洗涤方面的研究更加关注。1.3.2.2纤维素酶的降解理论虽然降解纤维素的酶已经清晰，但是具体这3种酶是如何协同作用的并没有一致的看法。目前对于纤维素酶作用机理的研究还停留在验证假说的层面。现在大[52]家比较认可的有3种假说。（1）C1—Cx假说该假说由Reese于1950年提出，Reese认为，纤维素-6- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文的降解首先是由C1酶作用到结晶纤维素分子内部的无定形区域，将纤维素分子变为带有大量非还原性末端的无定形纤维素，随后Cx作用于这些非还原性末端，水解β-1,4-糖苷键，形成纤维二糖和纤维三糖等低聚产物，最后再由β-葡萄糖苷酶发[54]挥作用将底物最终转化为葡萄糖，其中C1酶为降解的关键酶，直接决定纤维素降解效率。具体过程如图1-1图1-1C1-Cx假说这里面着重强调的是C1酶在降解纤维素过程中的决定性作用。目前来看，该[55]假说逐渐淡出人们视线。Wood认为，C1是只能从纤维素的末端连续分解产生纤[55]维二糖，是典型的水解酶。否则将无法实现对结晶纤维素的降解。（2）顺序作用假说该假说以Enari等人为代表，该假说提出，纤维素的降解首先是由CBH作用于不溶性维生素，随机的产生分子量较小的可溶性纤维糊精和纤维二糖，而同时纤维糊精在EG的作用下，降解为纤维二糖，最终由BG将[56]纤维二糖完全水解为葡萄糖，如图1-2。图1-2顺序作用假说（3）协同作用模型协同作用模型强调3种酶共同协作，缺少任何一种酶都不能将结晶纤维素降解为可溶性多糖。具体为，Cx负责找到结晶纤维素内部的无定形区域，以此为突破口，逐渐破坏结晶区域并产生新的末端，这时候由C1接[57]力，以纤维二糖为单位在末端脱落，最终由BG完成水解，如图1-3。图1-3协同作用假说-7- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文[58]高培基认为协同作用可以分为两个方面。一方面是物理结构的改变，纤维素酶分子在纤维素表面吸附的时候，会破坏分子间的氢键，分离出单一基元纤维，改变了纤维的结晶结构，有助于结晶区域的破坏，为后续降解提供便利；另一方面，酶的化学降解使得单一基元纤维素水解，得到可溶性多糖。此两方面因素互相协同先后发生并反复进行。1.3.2.3纤维素酶国内外研究进展[59]纤维素酶的发现始于1906年，Seilliere发现蜗牛的消化液能够降解天然纤[60]维素，自此拉开了纤维素酶相关研究的序幕。1912年Kellerma等人研究发现，在土壤中也存在着能够降解天然纤维素的微生物，并首次筛选出有纤维素降解能力的菌株，有效推动了纤维素酶的研究，随后人们围绕纤维素的降解和纤维素酶展[61]开了大量的研究。随着分子生物学技术的发展，Wood等人利用大肠杆菌E.colikoll为载体，克隆了欧式菌的纤维素内切酶基因，极大的提高了发酵体系中纤维素酶活性，拓宽了纤维素酶的获取渠道，提供了大规模降解纤维素的新思路。20世[61]纪60年代，微生物的共培养技术逐渐兴起，P.J.Weimer和J.G.Zeikus在1977年发现，具有纤维素降解能力的微生物在与特定的菌种共培养比单独培养该菌种有[62]着更高的纤维素降解能力。随后M.Fondevila等人研究发现，不具有纤维素降解能力的菌株能够提高特定纤维素降解菌对纤维素的降解效率。2005年Toshiaki[63]Nakajima-Kambe等人发现，NR-1或NR-2菌株能够提高硝酸盐还原菌的反硝化[13]作用。2011年DongS等人对嗜冷菌降解纤维素的研究进展进行了讨论。与国外的研究相比，国内对纤维素酶的研究起步较晚，但也取得了一定的成果，分离筛选出抗逆性强、降解效率高、应用范围广的纤维素降解菌。从19世纪60年代开始，由北京农学院率先分离纯化出我国第一批产纤维素酶微生物。李亚冰等人[64]成功利用生物诱变手段，筛选出产酶能力高的突变菌株，并以此为基础，进行了[65]相关研究，证实了其产酶能力和降解效能；1975年谭宏等人分离出了能够广泛应用到实际生产中的纤维素降解菌——长梗木霉，是我国第一次选育出该类型菌[66]株；随后崔福绵等人又成功筛选出一株高产纤维素酶突变菌株，并对康宁木霉[67]CP88329的产生条件进行了讨论；2002年，崔宗均等人从田间堆肥中筛选出4株纤维素高效降解菌，并成功构建出一个降解效率极高且生长极其稳定的纤维素降解混合菌剂MC1，后续实验表明，MCl在3天时间内对滤纸浆和脱脂棉絮的分[68]解率可分别达到94%和98%；2004年刘北东科研团队对CxⅠ基因与CxⅤ基因进行了克隆，是我国第一次成功克隆出纤维素酶相关基因，填补了空白。进十年来，-8- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文国内对纤维素酶和纤维素降解菌的研究日渐增多，越来越多的纤维素降解菌被分离筛选出来，同时也构建出了相当量的混合菌剂，并已投入到实际生产应用当中。1.4纤维素降解混合菌剂的研究概况由于纤维素在分子结构上存在结晶区，木质素和半纤维素紧密结合在一起将纤维素包裹其中，使得微生物以及纤维素酶的降解难度大大提升。受到单一微生物酶系和产酶能力的局限性制约，单独某种微生物很难完全将纤维素降解，即使能够降解，效果也不尽人意，无法与混合菌系的降解效能相提并论。事实上，自然界中对纤维素的降解也都是多种微生物产生的多种组份酶共同作用。我们在实验室条件下，可以从自然界中筛选分离出多种具有纤维素降解能力的微生物，并人工构建出生长互促、酶系互补的纤维素降解优势菌系，通过对菌种配比的优化，使得纤维素降解达到理想的水平。同时，在混合培养体系中，纤维素降解的中间产物或终产物能够及时被生长特性不同的菌株所利用，大大降低了降解产物的反馈抑制作用，[69]间接的促进了纤维素的降解。对纤维素降解混合菌剂的相关研究也成为了生物降解的一个新热点。综合国内外目前的研究来看，混合菌剂的菌种选择一般在2～3种，由于实验室条件的制约和数据分析方法的局限，一般很少有超过5种菌共作[70]的研究。1.4.1影响纤维素混合菌剂构建的因素（1）纤维素降解菌的类别自然界中，每种纤维素降解菌都有着自己的降解方式，细菌、真菌和放线菌中都存在纤维素降解菌，但是由于它们在生长特性、代谢途径、产酶能力和种类的不同，导致它们在利用消化纤维素的方式上也各有差异，有的是由外向内的降解，有[71]的是由内而外的降解。具有纤维素降解能力的真菌大多是纤维素内部逐渐向外降解。这取决于真菌的生长特性和产酶方式。具有纤维素降解真菌一般是丝状真菌，如木霉属、青霉属。丝状真菌的菌丝穿透力极强，可以轻易穿过木质素和半纤维形成的降解屏障，直接延伸到与纤维素成分接触，并且这类真菌产生的纤维素酶大多是胞外酶，由菌丝直接分泌到胞外，这就极大的提高了纤维素酶与底物的接触，提升了降解效能。目前文献中提到的纤维素降解真菌大多集中在纤维的内部，像枯草杆菌等可以产生分-9- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文泌到菌体外部的纤维素内切酶，可以使纤维素分子结构由内向外遭到破坏，从而达到降解纤维素的目的。而具有纤维素降解能力的细菌则不同，除了少数细菌除外，细菌对纤维素的降解都是纤维小体结构发挥作用。大多数纤维素降解细菌产生的酶都是胞内酶，无法直接与纤维素接触，只能依附在细胞内表面形成纤维小体，通过细菌菌体与纤维素的接触才能达到降解效果，从菌体与底物接触的位置开始分解纤维素，由外向内逐渐降解，所以我们看到的细菌降解后的纤维素结构边缘会呈现锯齿状。这种形式的降解严重制约着细菌降解纤维素的效率，对于具有复杂结构的纤维素来说，单独的某种细菌的降解效果并不理想。放线菌能够产生活性较高的外切纤维素酶和内切纤维素酶，同时这些酶主要是胞外酶，与真菌降解纤维素的方式大抵相同。值得一提的是，放线菌产生的胞外纤维素酶对碱性环境具有较强的耐受性，在一些强碱条件下也能有很好的表现。从细菌、真菌和放线菌的产酶方式、产酶种类、降解方式等综合来看，我们将不同类别的微生物按照纤维素降解实际需要进行混合培养，能够有效的弥补单一菌株在纤维素降解方面的局限性。因此，科学合理的构建纤维素降解混合菌系在纤维素降解乃至生物质利用上都有很大的发展空间。（2）培养条件及降解底物每种微生物对各种底物的降解过程并不相同，即使是同种菌株在不同的培养条件下对相同的底物降解过程也不相同。在利用微生物对纤维素生物降解的过程中，选择不同的培养条件和底物都会影响微生物对纤维素的利用效能。对于纤维素降解混合菌剂来说，这种培养条件和降解底物对降解效能的影响更为复杂。罗辉等人通过在混合菌剂中加入刺激因子或者诱导物，从而大大提高了天然纤维素降解[72]菌剂的降解效能，将产甲烷菌的产甲烷效率显著提升。因此在构建纤维素降解混合菌剂的过程中充分考虑培养条件和对不同底物的降解效果是十分必要的。1.4.2混合菌剂的构建混合菌剂的稳定性是每种组份微生物良性生长、稳定代谢的前提，而这种稳定[73]性依托于组成混合群菌的微生物的多样性。目前研究人员大多是从不同的环境中通过限制性培养技术直接分离筛选出具有纤维素降解能力的天然混合菌剂，继而进行后续的相关研究；构建混合菌剂的另一种思路则是先通过传统的分离筛选、分子生物学手段或者物理方法诱变，得到某一种具有纤维素降解能力的高效菌株，-10- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文然后根据其生长特性、功能分工和降解能力的差异，将酶系互补、功能互补、生长互促的高效菌株进行交叉组合，进而获得能够高效降解纤维素的混合菌系。1.4.3国内外纤维素降解菌（群）研究进展[74-78]根据相关文献描述，现阶段国内外对纤维素降解的研究包括但不限于：单一高效降解菌株的分离、筛选、鉴定、诱变及分子生物学改造；混合菌剂的构建、优化以及功能菌的实际降解效能研究；产酶能力、酶的作用方式以及相关生物酶产品的实际应用等方面。一些能够在特殊条件下发挥降解作用的产酶微生物正受到[79]广泛关注，例如，耐高（低）温纤维素降解菌和中（碱）性纤维素酶产生菌。相对于单一菌株的探索，混合菌系的研究正在逐渐占领研究市场。国内外很多学者认为，利用微生物降解纤维素为生物质的循环利用提供了全新的思路。事实证明，纤维素降解菌在酒精生产工业中已经占有一席之地，它能够产生可溶性多糖和单糖，为酵母菌提供发酵底物，节约了酒精生产成本。纤维素降解混合菌剂的研究正逐渐深入。[80]国外方面，Lewis等人将反刍动物的瘤胃微生物与纤维素降解菌S85混合培[81]养，大大增强了纤维素降解能力；Ueno等筛选出一株产氢的厌氧混合菌剂；Bell[82]等人将自然界中筛选到的微生物制成菌悬液，从菌落的代谢水平上测定了菌株[83]之间的协同作用；Arora研究发现，将几种白腐菌混合后能够提高木质素的降解[84]效果;Stepanova分别单独和混合培养了白腐菌和丝状真菌，验证了混合体系对纤[85]维素各种成分的利用率都高于单一菌种；Baldrain团队研究表明，混合菌系能够提高漆酶产生菌的产酶能力，一些外来菌种能够有效提高原菌株的产酶能力，而哈茨木酶甚至能够促使没有漆酶活性的白腐菌具有漆酶活性;近年的研究表明，混合[86]菌系的构建能够大大提高整体的抗逆性、适应性和代谢能力，近藤道雄从微生[87]物生态学的角度证明了微生物的多样性能够提高整体系统的稳定性；Kato等通过去掉混合菌系中的某种菌株，证明了无纤维素降解能力的微生物对纤维素降解的作用，表明这些非纤维素降解菌在调节环境、稳定体系和缓解产物抑制等方面发挥积极作用。Murrya将Bacetoridescellulosolvens和Clostridiumsaccharolyticum混合培养，B．cellulosolvens分解纤维素后的产物是C．saccharolyticum生长所需的碳源，B．cellulosolvens产生的有毒代谢产物被C．saccharolyticum利用消除，减[88][89]弱了对分解纤维素的反馈抑制。Coughlan等研究多种真菌联合降解麦秆中木质素得出腐菌(Deadaleaflavida)和黄孢原毛平革菌(Phanerochaelechrysosporium)的-11- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文[90]协同组合效果最佳，可使木质素降解达到36.27%。KashimaY等研究发现混菌组合培养后能提高它们的产漆酶能力，变色栓菌（Crrcmetesversicolor）与哈茨木霉（Trichodennaharzianum）共培养后产漆酶能力提高40倍，哈茨木霉使16株白腐菌产漆酶能力增强，甚至能诱导不产漆酶白腐菌产生漆酶。[91]国内方面，刘幼强以甘蔗渣为底物筛选并构建了一组高效降解甘蔗渣的菌剂，并分析了组份间的相互作用，虽然存在一定的生长抑制，但是其产酶种类能够互相补充，还发现体系中存在一株能够促进甘蔗渣降解的非纤维素降解菌；崔诗法[92]等选取枯枝落叶为实验材料，成功构建了纤维素降解菌剂St-13，并优化了其产[93]酶条件；卢月霞等将筛选出的3株纤维素降解细菌和1株纤维素降解放线菌混合培养后发现，混合体系对纤维素的降解效率较单菌株最高降解效率提高了1倍；[94]张晓伦将筛选出的3株高效纤维素降解菌两两混合，发现混合体系的FPA酶活[95]性是单一菌株的2.5倍；郭夏丽等人经过二次复配得到了一组降解秸秆的微生物菌剂并讨论了其降解特性，研究表明，不同菌株之间在生长、代谢方面存在着相互[96]促进的作用，同时混合菌剂的稳定性和酶系的全面性都有很大提高；王丽等将3株真菌与饲料酵母混合培养并以水稻秸秆检验了降解能力，发现对秸秆纤维的降[97]解率提高了38.5%；林捷等人的研究表明，利用共培养技术可以降低可溶性多糖的产物抑制，提高菌系对还原糖的耐受性。从目前的研究成果来看，虽然纤维素降解混合菌系有着更高的降解效率，但是其中的协同作用机制还不甚清晰，对于自然界中的不同纤维类别的研究还不够深入，同时，能够在实际生产中应用的高效菌剂还比较少。因此，要完成各类纤维的高效利用，还需要加强基础理论研究和实际应用的探索。1.5主要研究内容及技术路线主要研究内容有：1.纤维素降解菌的筛选。利用限制性培养技术手段从实验室保存的细菌和真菌中初步筛选，并通过纤维素总酶活性的测定排除假阳性结果，选出具有纤维素降解能力的菌株，并验证筛选出的纤维素降解菌共培养的可行性；2.纤维素降解混合菌剂的构建。将筛选出的菌株按测定并比较混合菌剂与单菌发酵的FPA酶活力差异，验证混合菌剂的纤维素降解效能优于单一菌株；3.混合菌剂产酶条件的优化。利用单因素试验方法，对混合菌剂进行产酶条件优化，确定混合菌剂最佳的产酶温度、初始pH、盐度、摇床转速和接种量。-12- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文4.混合菌剂菌种配比的优化。利用正交试验方法，以纤维素酶活为指标，对各菌种的配比进行优化，得到产酶最佳的菌种配比。5.混合菌剂降解效能的初步探究。分别以水稻秸秆、玉米秸秆、小麦秸秆为底物，探究混合菌剂对不同发酵底物的降解情况。本实验的主要技术路线如图1-6：图1-6主要研究内容及技术路线-13- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文第2章实验材料与方法2.1实验材料2.1.1试验菌种及来源本实验供试菌种及来源如表2-1所示。表2-1供试菌种及来源供试菌种拉丁名来源黑曲霉Aspergillusniger实验室现有菌种绿色木霉Trichodermaviride实验室现有菌种地衣芽孢杆菌BaclicuslincheniformisPWD-1实验室现有菌种毛壳菌Chaetomiumglobosum实验室现有菌种枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis实验室现有菌种解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens实验室现有菌种2.1.2所用培养基种类及配方实验中所用到的培养基及配方如表2-2～表2-7。表2-2PDA培养基配方PDA培养基/L成分及含量/g葡萄糖20新鲜马铃薯块200NaCl10琼脂粉15加水定容至1L表2-3产孢培养基配方产孢培养基/100mL成分及含量/g自来水25小麦50-14- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文表2-4LB培养基配方LB培养基/L成分及含量/g胰蛋白胨10酵母粉5.0NaCl10加水定容至1L*注：在体系中加入15g琼脂可制得LB固体培养基表2-5CMC-Na培养基配方CMC-Na培养基/L成分及含量/gCMC-Na15.0酵母膏1.0NH4NO31.0MgSO4·7H2O0.5KH2PO41.0琼脂15.0加水定容至1L表2-6产酶培养基配方产酶培养基/L成分及含量/g豆饼粉5.0麸皮2.0秸秆粉（40目）8.6尿素0.3蛋白胨1.0KH2PO42.0K2HPO40.5MgSO4·7H2O0.3CaCl20.3(NH4)2SO41.4Mandels盐溶液10.0加水定容至1L-15- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文表2-7发酵培养基配方发酵培养基/L成分及含量/g各类纤维素生物质20酵母粉0.5胰蛋白胨1.0KH2PO42.0K2HPO40.5MgSO4·7H2O0.5CaCl2·2H2O0.3MnSO4·H2O0.0016ZnSO40.0014CoCl20.0020加水定容至1L*初始pH调节为7.02.1.3实验药品及试剂2.1.3.1实验中所用试剂的配置方法DNS试剂：将6.3克3,5-二硝基水杨酸和262ml2mol/L氢氧化钠，加到500ml含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5克重苯酚和5克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容到1000ml，即制成DNS试剂，贮于棕色瓶中放置一周后备用。Mandels盐溶液：准确称取FeSO4·7H2O2.0g，MnSO4·H2O1.6g，ZnSO4·7H2O1.4g，CoCl22.0g，依次加入到1L的烧杯中逐个溶解，加水定容至1L，然后用1MHCl调节其pH至5.5。刚果红染液：准确称取0.35g刚果红固体，加水定容至500mL，待充分溶解后得到7g/L的刚果红染液，留存备用。HAC-NaAC缓冲液：精确称量NaAc21.15g，量取HAc40mL，震荡混匀后将溶液定容至500mL，备用。柠檬酸缓冲液：准确称量10.5g柠檬酸并用少量双蒸水充分搅拌后定容至1L，调节pH为5.0，得到0.05mol/L的柠檬酸缓冲液。-16- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文中性洗涤剂：精确称量18.6gEDTANa2和6.8g四硼酸钠至1L的烧杯中，加入少量ddH2O后放入高温加热溶解，再加入30.0gSDS并用搅拌器充分混匀，待溶液呈现澄清并带有少量气泡后加入10mL乙二醇乙醚混匀。之后，加入适量ddH2O溶解4.56gNa2HPO4，定容到1L备用。酸性洗涤剂：用移液枪抽取27.87mL98%的浓硫酸用玻璃棒引流缓慢滴加500mLddH2O中，待温度稳定后，向体系内加入20gCTAB搅拌混匀，待液体呈现透明并带有少量气泡证明溶解完全，将溶液定容到1L即可，备用。2.1.3.2实验药品及产家本实验所涉及药品及厂家如表2-8。表2-8实验药品及厂家药品名称生产厂家牛肉膏北京奥博星生物技术有限责任公司TRYPTONEOCOIDLTD.,BASINGSTOKE,HAMPSHIRE,ENGLAND酵母粉北京奥博星生物技术有限责任公司琼脂粉北京奥博星生物技术有限责任公司MgSO4·7H2O天津市巴斯夫化工有限公司KH2PO4天津市巴斯夫化工有限公司CNC-Na天津市巴斯夫化工有限公司EDTABeijingBiotopped.Science&TechnologyCO.LTD四硼酸钠天津市瑞金特化学品有限公司SDSBeijingBiotopped.Science&TechnologyCO.LTD乙二醇乙醚天津市巴斯夫化工有限公司CTABBeijingBiotopped.Science&TechnologyCO.LTD十氢萘国药集团化学试剂有限公司丙酮天津市富宇精细化工有限公司3,5-二硝基水杨酸天津市巴斯夫化工有限公司苯酚天津市东丽区天大化学试剂厂重铬酸钾天津市化学试剂一厂氯化钴天津市瑞金特化学品有限公司硫酸锌天津市瑞金特化学品有限公司-17- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文2.1.4实验仪器及设备实验中涉及到的仪器设备的生产厂家及型号如表2-9所示。表2-9实验仪器设备仪器名称生产厂家及型号pH计Sartorius/PB-10型高温高压蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂/LDZX-40AI型®高速冷冻离心机美国贝克曼库尔特公司/AllegraX-22Centrifuge®台式离心机美国贝克曼库尔特公司/MicrofugeX-22RCentrifuge标准超净工作台苏净集团苏州安泰空气有限公司/SW-CJ-1B型电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂/HH·B11420-S型水浴锅河北黄骅市航天仪器厂/DZKW-C型电子调温电热套天津市泰斯特仪器有限公司SHB-III循环水式多用真空泵上海卫凯仪器设备有限公司数显鼓风干燥箱上海博讯事业有限公司医疗设备厂箱式电阻炉北京市永光明医疗仪器厂微型植物试样粉碎机北京市永光明医疗仪器厂连续波长酶免分析系统BIO-RADiMarkMicroplateReader电子天平上海梅特勒-托利多仪器有限公司/AE100S振荡培养箱哈尔滨市东联电子技术开发有限公司/HQZ-X100型Milli超纯水制备系统美国Millipore公司光学显微镜日本奥林巴斯/BX51型紫外分光光度计上海美谱达仪器有限公司2.2实验方法2.2.1受试菌种的活化及筛选（1）菌种的活化本实验所选取的受试菌株均为实验室保藏，要先使菌种恢复活性和生产性能。-18- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文细菌的活化将菌种从-80℃冰箱中取出，转接到LB试管中，37℃震荡培养24h，备用。真菌的活化将保藏的真菌从保存斜面转接到PDA固体平板上，28℃恒温培养3～5天至长势良好，留存备用。（2）纤维素降解菌的定性筛选先真菌先将用ddH2O将真菌孢子从平板上洗脱，转移至250mL锥形瓶中，制-3-6得菌悬液。分别将不同细菌和真菌的菌悬液梯度稀释10～10倍，取5个不同梯度的菌悬液200µL，涂布到CMC-Na固体平板上，每个浓度梯度设置3组对照实验，分别将细菌置于37℃，真菌置于30℃恒温培养，7天后观察菌落生长情况，进行刚果红染色。刚果红染色刚果红染液可以与培养基中的多糖结合，使培养基染色。而产纤维素酶的微生物可以降解多糖底物，通过NaCl溶液的作用可以将染液洗脱，从而产生透明圈。在长出但菌落的平板上倒入适量7mg/mL的刚果红染液，染色20min，倾倒染液，并用1M的NaCl溶液进行洗脱，20min后倒去洗脱液，若染色较深可以用1M的NaCl溶液再次浸泡洗脱。此时，能够降解CMC-Na的菌落周围就会残生透明圈。（3）纤维素降解菌的定量筛选为排除刚果红染色的假阳性结果，需要对透明圈实验中的阳性菌株进行定量筛选，以纤维素总酶活（FPA酶活）为指标，进行酶活测定，具体方法详见2.2.4。2.2.2不同菌株之间的拮抗实验不同菌株能否在同一培养条件下共生是混合菌剂构建的先决条件，拮抗实验能够有效的验证不同菌株之间是否存在生长抑制。考虑到细菌和真菌生长对培养环境的差异，我们选择加入胰蛋白胨的PDA培养基，培养温度设置为30℃。由于本实验中涉及到2株真菌、1株细菌，生长速度存在差异，所以我们采用两两相组合的方式进行验证生长抑制是否存在。对于真菌之间的拮抗实验，用无菌7mm打孔器在长势良好的平板中分别取3个菌饼，在PDA固体培养基表面按正六边形方式接种，每个顶点交替接种黑曲霉与绿色木霉，菌饼倒置，30℃恒温倒置培养5～7d，观察菌落生长状态。对于细菌与真菌的拮抗实验，采用菌悬液混合涂布的方式进行。首先通过梯度3稀释制备菌体（孢子）浓度在10个/mL的菌悬液，分别取200µL涂布在同一个-19- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文加入了胰蛋白胨的PDA固体培养基中，考虑到生长速度的差异，选择在30℃恒温倒置培养3～5d，观察菌落生长状态。若三种微生物两两混合培养的结果中有一组产生了明显的抑菌圈，则证明该组合的菌种之间存在拮抗作用，组内菌株无法用于构建混合菌剂；若3个组合均不产生明显的抑菌圈，则证明三种微生物之间不存在拮抗作用，能够用于构建稳定的混合菌剂。2.2.3生长曲线的测定（1）分光光度法测定细菌生长曲线用无菌移液器吸取活化后的细菌悬液200µL，接种到LB液体培养基中，同时设置对照组，对照组接种等量的ddH2O，分别置于摇床上37℃，160rpm培养。每隔2h吸取一定的菌液，置于600nm波长下检测其吸光度，为保证OD值与菌落密度的线性关系，我们需要通过对菌悬液的稀释来保证OD值处于0.6～0.8之间，超过0.8时要对菌悬液进行稀释。对照组与实验组分别进行3次测量，取均值记录，直至转化后的OD值，趋于稳定后再测量2次，停止测量。以OD值为纵坐标，时间为横坐标绘制出细菌的生长曲线。（2）孢子计数法测定真菌生长曲线由于真菌在生长过程中会产生大量的菌丝，液体培养下以菌丝球的形式存在形成浊液，无法通过分管光度法直接测定其OD值。本实验中的2株真菌均为产孢子真菌，因此本实验选择利用固体培养下的孢子计数法准确反映真菌的生长趋势。用7mm灭菌打孔器从涨势良好的产孢真菌平板上取2～3块菌饼，接种至小麦固体培养基中，充分搅拌，对照组接种等量的空白培养基，每隔24h取样1次，将取的样品放置天平上准确称重后，溶于10mL的ddH2O中，根据菌落生长时间的差异，稀释到合适的倍数后，放置在血球计数板上显微镜下观察计数，并计算出单位质量培养物孢子数，每次设置3组平行实验。每次取样的同时用灭菌玻璃棒充分搅拌，充分保证培养体系的均一稳定。直至单位质量的孢子数保持稳定后，再测定2次，结束检测。以单位质量的孢子书为纵坐标，以时间为横坐标，绘制真菌生长曲线。-20- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文2.2.4DNS法测定纤维素酶活[98]菌悬液经过离心后得到粗酶液，使用IUPAC所述方法测定各种纤维素酶活，分别以2%CMC-Na、1%微晶纤维素、纤维二糖、滤纸条为底物，测定纤维素内切酶、外切酶、β-糖苷酶和FPA酶活。以1min内产生1µmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位（U）。（1）葡萄糖标准曲线的绘制配置1.0mg/mL的葡萄糖标准溶液50mL，取带有刻度的25mL的试管，按表2-10所示配置混合溶液，混匀后在沸水中加热5分钟，取出后迅速在冷水中冷却，稀释7倍。以1号葡萄糖溶液作为对照，以波长540nm测吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线，如图2-1。表2-10葡萄糖标准液编号葡萄糖标准液（mL）柠檬酸缓冲液（mL）DNS（mL）102.01.520.21.81.530.41.61.540.61.41.550.81.21.561.01.01.571.20.81.581.40.61.591.60.41.5101.80.21.5图2-1葡萄糖标准曲线-21- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文2其中R=0.9955>0.95，证明OD540nm与葡萄糖浓度的线性关系可靠，可以作为标准曲线。（2）酶活测定每个样品取3mL发酵液，置于离心管中，4℃12000rpm，离心10min，若上清液仍然较混浊，可再次离心取上清液。将上清液分为两个部分，实验组取1.5mL粗酶液，对照组取1.0mL粗酶液，分别置于试管中。向实验组中与对照组分别加入等体积的柠檬酸钠缓冲液，将不同底物按标准投放至试管中，60℃水浴30min。然后取反应液4℃12000rpm，离心10min，分别取1.0mL置于新的EP管中，按1:0.75的比例向体系内加入0.75µLDNS混匀，沸水浴10min后冷却至室温，取20µL反应液至96孔板，并按1:7的比例加入140µL的ddH2O，轻轻震荡混匀后置于全自动酶标仪540nm波长下检测OD值，与按照绘制的葡萄糖标准曲线，将OD值换算成葡萄糖浓度，以1min内产生1µmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位（U）。酶活计算公式如下：���×10*酶活U=180����×����×�（��）其中G代表葡萄糖浓度，T代表反应时间，V代表粗酶液体积。2.2.5单因素优化实验本实验选取温度、初始pH、盐度、摇床转速、接种量5个因素，对混合菌剂的产酶条件进行单因素优化。（1）温度的优化由于混合体系中既有真菌又有细菌，本实验将温度设定为28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃6个梯度，保持其他初始条件相同，将产酶培养基置于不同温度下培养，连续测量其FPA酶活，每组测量重复3次，取平均值。记录FPA酶活水平，比较不同温度下能达到的最大酶活，确定最优温度。（2）初始pH的优化本实验将初始pH设定为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0共6个梯度，保持其他初始条件相同，将产酶培养基置于恒温摇床中培养，连续测量其FPA酶活，每组测量重复3次，取平均值。记录FPA酶活水平，比较不同初始pH条件下能达到的最大酶活，确定最优初始pH。（3）盐度的优化-22- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文本实验将盐度设定为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%共5个梯度，保持其他初始条件相同，将产酶培养基置于恒温摇床中培养，连续测量其FPA酶活，每组测量重复3次，取平均值。记录FPA酶活水平，比较不同盐度下能达到的最大酶活，确定最优盐度。（4）摇床转速本实验将摇床转速设定为120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm共5个梯度，保持其他初始条件相同，将产酶培养基置于恒温摇床中培养，连续测量其FPA酶活，每组测量重复3次，取平均值。记录FPA酶活水平，比较不同温度下能达到的最大酶活，确定最优摇床转速。（5）接种量本实验将接种量设定为1%、2%、3%、4%、5%共5个梯度，保持其他初始条件相同，将产酶培养基置于恒温摇床中培养，连续测量其FPA酶活，每组测量重复3次，取平均值。记录FPA酶活水平，比较不同接种量下能达到的最大酶活，确定最优接种量。2.2.6菌种配比的正交优化4本实验拟优化混合菌剂的菌种配比，因此利用SPSS软件设计L9（3）正交试8验，以FPA酶活为指标，选择最优的菌种配比。分别制得浓度为10数量级的菌（孢子）悬液，加入空列有效消除实验的系统误差，每个因素分别设置3个实验水平，因素水平表见表2-11。按照表2-12的实验序号设计正交试验。表2-11因素水平表单位：mL因素水平黑曲霉（A）绿色木霉（B）地衣芽孢杆菌（C）ddH2O（D）10.50.50.50.521.01.01.01.031.51.51.51.5正交优化中选择混合菌剂产酶条件优化结果测样时间选择为9d。在确定混合菌剂最优菌种配比的同时，也能够确定混合菌剂在最优条件下能达到的最大FPA酶活。正交试验结果通过统计学分析能够得出配比最优解，同时与实验得出的产酶-23- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文最佳组合进行比对，如果分析得到最优组合出现在正交表中，则确定最优组合；否则，需进一步比较，二者择其优，得到最优组合。4表2-12L9（3）正交试验表因素序号ABCD1111121222313334212352231623127313283213933212.2.7范式洗涤法测纤维素成份为得到混合菌剂对不同纤维素生物质的降解效能，我们通过测量发酵前后纤维素组份含量的变化可以得到对不同组分的降解率数据。本实验采用范式洗涤法分析纤维素中各组分含量。范式分析方法如图2-2。（1）中性洗涤纤维测定准确称取1.0000g样品（通过40目筛）置于直筒烧杯中，加入100ml中性洗涤剂和数滴十氢化萘及0.5g无水亚硫酸钠。将烧杯套上冷凝装置于电炉上，在5~10min内煮沸，并持续保持微沸60min。煮沸完毕后进行过滤，将烧杯中的残渣全部移入，并用沸水冲洗玻璃坩埚与残渣，直洗至滤液呈中性为止。用20ml丙酮冲洗二次，抽滤。（2）酸性洗涤纤维测定准确称取1.0000g样品置于直筒烧杯中，加入100ml酸性洗涤剂和数滴十氢化萘及趁热用已知重量的玻璃坩埚抽滤，并用沸水反复冲洗玻璃坩埚及残渣至滤液呈中性为止。用少量丙酮冲洗残渣至抽下的丙酮液呈无色为止，并抽净丙酮。将玻璃坩埚置于105℃烘箱中烘2h后，在干燥器中冷却30min称重，直称至恒重。（3）酸性洗涤木质素和酸不溶灰分测定-24- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文将酸性洗涤纤维加入72%硫酸，在20℃消化3h后过滤，并冲洗至中性。消化过程中溶解部分为纤维素，不溶解的残渣为酸性洗涤木质素和酸不溶灰分，将残渣烘干并灼烧灰化后即可得出酸性洗涤木质素和酸不溶灰分的含量。图2-2范式分析法示意图中性洗涤纤维含量的计算：（�8−�:）NDF%=×100�式中：W1—玻璃坩埚和NDF重（g）W2—玻璃坩埚重（g）W—试样重（g）酸性洗涤纤维含量的计算：（�8−�:）ADF%=×100�式中：G1—玻璃坩埚和ADF重（g）G2—玻璃坩埚重（g）W—试样重（g）半纤维素含量的计算：半纤维素%=NDF（%）－ADF（%）纤维素含量的计算：纤维素%=ADF%−经硫酸处理后的残渣（%）酸性洗涤木质素（ADL）含量的计算：ADL%=残渣（%）－灰分（%）-25- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文第3章纤维素降解菌的筛选及混合菌剂的构建为构建纤维素降解混合菌剂，首先需要筛选出具有纤维素降解能力的菌株，目标菌株通过一系列验证后方可组建混合菌剂。本实验从实验室现有菌株中挑选3株真菌、3株细菌共6株潜在纤维素降解菌，经过限制性培养技术初步定性筛选，在通过FPA酶活测定，定量的筛选出具有纤维素降解能力的菌株。构建混合菌剂需要微生物之间不存在拮抗作用，由于纤维素结构复杂，降解过程需要不同酶系的参与，所以我们对纤维素降解菌的酶系进行研究，确保混合菌剂各组分之间能够共生、酶系互补。3.1菌株的筛选3.1.1定性筛选将实验室保藏的3株细菌（解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌）和3株真菌（黑曲霉、绿色木霉、毛壳菌）活化后分别接种到以CMC-Na为唯一碳源的固体平板上，分别置于37℃和30℃恒温培养。3～5d后，取长势良好的平板进行刚果红染色实验。实验结果如图3-1。图3-1刚果红染色图a：绿色木霉b：毛壳菌c：地衣芽孢杆菌d：黑曲霉刚果红能把纤维素染成红色混合物，对纤维二糖和葡萄糖无作用，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的混合物便没法形成，培养基中会出现以木笔啊菌株为中心的透明圈，通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。对于产生透明圈的菌株，从三个方向分别测量其菌落直径，取平均值，记为d；用同样的方法测量-26- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文透明圈的直径，记为D。我们用D/d的值来初步衡量纤维素降解能力的强弱，数据见表3-1。表3-1不同菌株D/d值菌落直径透明圈直径菌种比值（D/d）（d）／cm（D）／cm黑曲霉3.24.01.25绿色木霉1.62.11.31地衣芽孢杆菌1.41.61.14毛壳菌1.51.61.07枯草芽孢杆菌0.7——解淀粉芽孢杆菌0.7——从表3-1可知，不同菌株是否产生透明圈以及产生透明圈的大小和比值是有明显差异的。数据表明，绿色木霉、黑曲霉、地衣芽孢杆菌和毛壳菌实验结果呈阳性，并且D/d值依次递减，初步判定4种菌都具备纤维素降解能力。而枯草芽孢杆菌杆菌与解淀粉芽孢杆菌染色结果为阴性，几乎在CMC-Na平板上不生长，值得注[99-102]意的是，近年来国内很多报道表明解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌是能够产纤维素内切酶，具有纤维素降解能力。出现本实验结果可能的原因是，菌种在保藏前传代次数过多或者保藏期过长导致菌种纤维素降解能力的退化。另外，产生透明圈并不是一株菌具备纤维素降解能力的充要条件。部分细菌能够分解色素或者分泌降解色素的活性物质，导致刚果红染色易出现假阳性结果，无法准确判断菌株是否为纤维素降解菌。因此需要进一步以FPA酶活为指标，定量筛选各阳性菌株的产酶能力。3.1.2定量筛选为排除刚果红染色实验的假阳性结果，对4种阳性菌株进行发酵，测量其FPA酶活，进一步确定菌株的纤维素降解能力。将4种菌株按1%比例接种到发酵培养基中，分别置于37℃和30℃恒温连续发酵15d，期间每天取样采用DNS比色法测定FPA酶活数据，根据数据绘制发酵周期内不同菌株Fpase随时间的变化规律如图3-2。在整个发酵周期内，黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌的FPase都呈现出先升高再逐渐降低的趋势。其中地衣芽孢杆菌因为其生长特性，发酵前期FPase增长最-27- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文快，在第3天达到了自身最大酶活，随后逐渐下降；黑曲霉的FPase明显高于其他菌株；绿色木霉FPase提升缓慢。图3-2不同菌株FPase变化规律实验结果表明，毛壳菌虽然能够降解纤维素底物，但是在整个发酵周期内的最大FPase仅为0.103U/mL，远远低于其他3株菌。故在构建纤维素降解混合菌系时不考虑毛壳菌，选择黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌作为混合菌剂的基础菌株进行下步实验。3.2纤维素降解菌剂的构建在构建混合菌系时要充分考虑菌种之间的相互影响。一方面要验证不同菌种之间能够互不影响的在同一培养体系内正常生长，甚至有促进作用；另一方面要验证不同菌种在功能上具有互补作用，对协同降解纤维素底物具有积极作用。因此，本节通过拮抗试验和酶活测定确定了菌株之间的共生关系和功能互补关系。由于本实验中涉及到2株真菌、1株细菌，生长特性并不相同。目标菌株中2株真菌在生长过程中会产生大量的气生菌丝而铺满整个平板，而细菌菌落相对小很多，难以清晰观察到抑菌圈的存在，无法准确判断是否存在生长抑制。所以我们采用两两相组合的方式进行验证生长抑制是否存在。对于真菌之间的拮抗实验，用无菌7mm打孔器在长势良好的平板中分别取3个菌饼，在PDA固体培养基表面按正六边形方式接种，每个顶点交替接种黑曲霉与绿色木霉，菌饼倒置，30℃恒温倒置培养5～7d，观察菌落生长状态。-28- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文对于细菌与真菌的拮抗实验，采用菌悬液混合涂布的方式进行。首先通过梯度3稀释制备菌体（孢子）浓度在10个/mL的菌悬液，分别取200µL涂布在同一个加入了胰蛋白胨的PDA固体培养基中，考虑到生长速度的差异，选择在30℃恒温倒置培养3～5d，观察菌落生长状态。3.2.1目标菌株之间的拮抗性实验平板对峙实验能够有效的检测菌株之间是否存在拮抗作用。本实验将3种菌株两两组合接种与加入了胰蛋白胨的PDA固体培养基中，30℃恒温培养，5～7d后观察长势，结果如图3-3。图3-3平板对峙实验结果a：黑曲霉Vs绿色木霉b：绿色木霉Vs地衣芽孢杆菌c：黑曲霉Vs地衣芽孢杆菌图3-3（a）中为黑曲霉与绿色木霉的对峙实验，能够清晰的看出黑曲霉的生长速度要快于绿色木霉，二者菌落之间无明显的抑菌圈，说明二者之间不存在拮抗作用；图3-3（b）和（c）是地衣芽孢杆菌分别与绿色木霉和黑曲霉之间的对峙实验，虽然2株真菌产生的气生菌丝已经铺满整个平板，同时也能够清晰的观察到地衣芽孢杆菌的菌落，且长势良好。平板对峙实验结果充分说明三者之间有竞争但不存在拮抗作用，满足构建混合菌剂的先决条件。3.2.2目标菌株的酶系互补实验构建纤维素降解混合菌剂不仅需要微生物之间能共生，酶系互补也是重要指标。利用DNS比色法，选择不同的底物对各目标菌株纤维素外切酶、内切酶和β-糖苷酶酶活进行测定，以酶活为纵坐标，以发酵时间为横坐标绘制目标菌株各功能酶随时间变化规律，得到各功能酶的具体酶活。不同菌株纤维素内切酶（Cx）酶活的比较如图3-4。从图中我们可以看到，绿色木霉Cx酶活是3种菌株里最高的，可达到3.912U/mL，Cx酶活随发酵时间增加呈现先提高后稳定的趋势，且持续作用时间较长，直到18d时才趋于稳定。黑曲-29- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文霉与地衣芽孢杆菌的最大Cx酶活基本相当，黑曲霉最大Cx酶活为2.588U/mL，地衣芽孢杆菌最大Cx酶活为2.086U/mL，但黑曲霉Cx的稳定作用时间明显优于地衣芽孢杆菌。地衣芽孢杆菌受到生长特性的制约，菌体从9d起开始逐渐凋亡，导致Cx酶活随之下降。图3-4不同菌株Cx酶活比较纤维素内切酶（Cx）能在纤维素酶分子内部任意断裂β-1,4糖苷键，能够随机的作用于纤维素分子的非结晶区域，但是对于末端的降解相对不敏感。在C1—Cx降解理论中，Cx的这种相对不敏感被忽略，认为Cx能否发挥作用完全受限于C1。这一问题在协同降解理论中被纠正并完善，这也是协同降解理论逐渐取代C1—Cx降解理论的重要原因。不同菌株纤维素外切酶（C1）酶活的比较如图3-5。图3-5不同菌株C1酶活比较-30- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文纤维素外切酶（C1）是破坏大分子纤维素复杂结晶区域的重要酶类，其活性高低直接影响混合菌剂对纤维素的降解效能。在构建混合菌剂时，要充分考虑纤维素内切酶（C1）的活性，同时注意不同菌株之间的互补作用。从实验结果来看，黑曲霉具有较高的C1酶活，可达2.934U/mL，而绿色木霉和地衣芽孢杆菌的C1酶活相对较低，只有1.294U/mL和1.043U/mL。不同菌株之间β-葡聚糖苷酶（BG）酶活比较如图3-6。图3-6不同菌株BG酶活比较β-葡聚糖苷酶（BG）是最终将纤维素各级降解产物转化成还原性糖的酶类，把控着纤维素降解的最后一关。从实验结果来看，BG酶活的数值要稍高于C1和Cx酶活，混合微生物的生长特性。黑曲霉和地衣芽孢杆菌都有着较高的BG酶活，黑曲霉BG酶活最高可达7.552U/mL，地衣芽孢杆菌最高BG酶活为6.44U/ml，同时综合图3-4、3-5来看，其酶活变化规律与其生长规律基本吻合。绿色木霉的BG酶活性相对较弱，最大只有3.33U/mL。本实验中，黑曲霉能够产生较高的C1酶活和β-1,4-葡聚糖苷酶活，而绿色木霉能够产生较高的Cx酶活，地衣芽孢杆菌有较高的β-1,4-葡聚糖苷酶活，与相关[103-104]报道一致。研究中注意到，对照图3-2中单一菌种的FPA酶活来看，其平均水平要低于3种酶单独作用时能够达到的最大酶活，从侧面印证了纤维素的降解并非是某一种酶单独作用的结果，也不是3种酶的简单叠加，由此可初步判断纤维素酶降解纤维素的过程是一个复杂的协同过程。综合实验结果来看，黑曲霉、绿色木霉与地衣芽孢杆菌三者在酶系能够相互补充，符合构建混合菌剂功能性互补的条件。因此，确定本实验最终用于构建混合菌剂的菌株为黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌。-31- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文3.2.3各菌种生长曲线的测定生长曲线能够反映微生物在生长周期内生物量的变化规律，对于研究微生物生长规律具有重要意义。上节中已确定用于构建混合菌剂的菌种，本节将对3种微生物的生长曲线进行测定。确定各个生长时期准确的生物量，为下步优化实验提供精准的接种量，经过稀释处理后可使不同微生物的菌（孢子）悬液浓度达到同一数量级，使实验过程可重复，数据可比较。（1）黑曲霉生长曲线的测定黑曲霉生长过程中产生大量的气生菌丝，无法直接获得菌体数量，在测量生长曲线方面，一般采用干重法和孢子计数法。本实验选择孢子计数法测定黑曲霉生长曲线，以黑曲霉孢子浓度为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制生长曲线如图3-7。图3-7黑曲霉孢子浓度随时间变化趋势从图中可以看出，黑曲霉生长的潜伏期为0～48h，此时生长较为缓慢，孢子产生量较小；对数生长期为48～96h，此过程黑曲霉大量迅速产孢，生长能力较为旺盛；平台期为96～216h，此时黑曲霉产孢量基本不变化，相对稳定，同时可以看出黑曲霉能够在较长时间内维持菌落的稳定性。（2）绿色木霉生长过程中产生大量的气生菌丝，无法直接获得菌体数量，在测量生长曲线方面，一般采用干重法和孢子计数法。本实验选择孢子计数法测定生长曲线。以绿色木霉孢子浓度为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制绿色木霉生长曲线，结果如图3-8所示。从图中可以看出，绿色木霉生长的潜伏期为0～48h，此时生长较为缓慢，孢子产生量较小；对数生长期为48～168h，不同于黑曲霉，绿色木霉此过程孢子数-32- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文属于稳定增长，并不特别明显；平台期为168～240h，此时绿色木霉产孢量基本不变化，相对稳定。绿色木霉菌落内部相对较稳定。图3-8绿色木霉孢子浓度随时间变化趋势（3）地衣芽孢杆菌生长曲线的测定细菌的生长可以直接形成菌悬液，在0.6～0.8范围内，菌悬液的OD600值与菌悬液内的生物量有着很好的线形关系。因此，其生长曲线可以直接用分光光度计OD600值来绘制。绘制过程中注意对菌悬液稀释到合适的倍数，使OD600与菌悬液浓度保持线性关系。生长曲线如图3-9所示。根据实验结果可知，地衣芽孢杆菌对数增长期并不明显，22～28h时有较大的吸光度，同时具有较高的生长活性。图3-9地衣芽孢杆菌随时间的变化趋势综合3株菌的生长曲线，黑曲霉的对数增长期为48～96h，绿色木霉的对数增长期为48～168h，地衣芽孢杆菌的为22～28h。为保证混合菌剂的初始生长活性和代谢水平，我们分别选择培养72h的黑曲霉、144h的绿色木霉和26h地衣8芽孢杆菌为种子，分别将菌（孢子）悬液稀释到10数量级，为混合菌剂的构建打好基础，同时使后续实验更加科学准确，具有可重复性。-33- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文3.3混合菌剂产酶能力测定通过3.2.3的实验，可以得到相同数量级浓度的菌（孢子）悬液。由于在后续实验中拟对混合菌剂菌种配比进行优化，故在此对菌种配比不做要求，先按照1:1:1的体积比构建混合菌剂。通过对混合菌剂纤维素酶活与单菌酶活的比较，可以初步判断混合菌剂对纤维素的降解能力和产酶特性，同时可以判断前期实验构建的混合菌剂的各种纤维素酶活水平是否优于单一菌株的酶活水平。本实验通过DNS比色法检测了混合菌剂与单一菌株的4种纤维素酶活，通过比对酶活数据，验证混合菌剂的产酶能力。3.3.1纤维素内切酶酶活的比较8取10数量级的菌（孢子）悬液，按1.5%（v/v）接种量接种到产酶培养基中，调节初始pH值为7.0，盐浓度为1%，置于摇床160rpm30℃恒温培养，每隔3d菌液进行测定，每次测量设置3组平行，记录酶活数据并比较结果。如图3-10。图3-10混合菌剂与单一菌株Cx酶活比较实验结果表明，混合菌剂的Cx酶活明显高于3株菌单独发酵的Cx水平。在发酵培养第15d，混合菌剂的最大Cx酶活可达到6.212U/mL，并且较为稳定。地衣芽孢杆菌在前3d达到最大酶活，其后迅速降低，符合其生长特性。综合来看，混合菌剂的纤维素内切酶（Cx）酶活较单独发酵的黑曲霉提高了1.5倍，较绿色木霉提高了0.6倍，较地衣芽孢杆菌提高了2.2倍。相比对单一菌株，混合菌剂的Cx酶活更加稳定。-34- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文3.3.2纤维素外切酶酶活的比较8取10数量级的菌（孢子）悬液，按1.5%（v/v）接种量接种到产酶培养基中，调节初始pH值为7.0，盐浓度为1%，置于摇床160rpm30℃恒温培养，每隔3d菌液进行酶活测定，每次测量设置3组平行，记录酶活数据。以C1酶活为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制各组酶活随时间的变化规律，如图3-11。实验结果表明，混合菌剂的C1酶活明显高于3株菌单独发酵的C1水平。混合菌剂的最大C1酶活可达到4.168U/mL，较单独发酵的黑曲霉提高了0.5倍，较绿色木霉提高了2.5倍，较地衣芽孢杆菌提高了4倍。在发酵12d后，随着地衣芽孢杆菌和绿色木霉C1酶活的下降，混合菌剂的C1酶活也相应下降，接近于黑曲霉的C1酶活水平。图3-11混合菌剂与单一菌株C1酶活比较3.3.3β-糖苷酶酶活的比较8取10数量级的菌（孢子）悬液，按1.5%（v/v）接种量接种到产酶培养基中，调节初始pH值为7.0，盐浓度为1%，置于摇床160rpm30℃恒温培养，每隔3d菌液进行酶活测定，每次测量设置3组平行，记录酶活数据。以BG酶活为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制各组酶活随时间的变化规律，如图3-12。实验结果表明，BG酶活从数值上来看相对较高，产酶能力最弱的绿色木霉的BG酶活也可达到2.417U/mL。混合菌剂的BG酶活明显高于3株菌单独发酵的-35- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文C1水平。混合菌剂的最大BG酶活可达到12.301U/mL，较单独发酵的任一菌株都有大幅度提高。图3-12混合菌剂与单一菌株BG酶活比较3.3.4纤维素总酶活的比较8取10数量级的菌（孢子）悬液，按1.5%（v/v）接种量接种到产酶培养基中，调节初始pH值为7.0，盐浓度为1%，置于摇床160rpm30℃恒温培养，每隔3d菌液进行酶活测定，每次测量设置3组平行，记录酶活数据。以FPA酶活为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制各组酶活随时间的变化规律，如图3-13。图3-13混合菌剂与单一菌株FPA酶活的比较实验表明，在相同的条件下，相比于单一菌株发酵，混合菌剂有着更高的FPA酶活，对纤维素的降解效果更佳。混合菌剂的FPA酶活最高可到达到3.652U/mL，而单一菌株的这个数值为2.565U/mL，总酶活提高了1.087U/mL。-36- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文综上，相同发酵条件下，混合菌剂在纤维素内切酶、外切酶、β-糖苷酶和总酶活上都显著高于菌剂内任何单一菌株。在温度为30℃、初始pH值为7.0、盐浓度为1%、接种量为1.5%（v/v）、摇床转速为160rpm的条件下，混合菌剂的纤维素内切酶酶活可达到6.212U/mL，纤维素外切酶酶活可达到4.168U/mL，β-糖苷酶酶活可达到12.301U/mL，FPA酶活最高可达3.652U/mL。3.4讨论本实验通过刚果红染色的定性筛选和以FPA酶活为指标的定量筛选，确定了黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌具有较强的纤维素降解能力，同时经过对峙实验和功能互补实验验证了3种菌株构建混合菌剂的可行性，成功获得一组由黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌构成的混合菌剂，并以纤维素内切酶酶活、纤维素外切酶酶活、β-糖苷酶酶活以及FPA酶活为指标，对混合菌剂的产酶能力进行了初步测定，结果显示混合菌剂的各酶活均高于任一单一菌株。实验结果发现，混合菌剂的内切酶酶活为6.212U/mL、外切酶酶活为4.168U/mL、β-糖苷酶酶活为12.301U/mL，而FPA酶活仅为3.652U/mL。相对于各种组分酶的活性总酶活反而要更低，可以从侧面证明，木质纤维素的降解绝不是各纤维素组分酶的简单叠加或者顺序作用，是3中组分酶协同作用的结果。对于纤维素酶的降解机理具有实际意义。3.5本章小结本章的目的是筛选出具有降解纤维素能力的目标菌株，通过定性和定量的筛选，确定可用于构建混合菌剂的潜在菌株。通过以CMC-Na为唯一碳源进行刚果红染色，结果显示为阳性的4株菌经过FPA酶活的定量测量后，毛壳菌被证明是假阳性结果，确定了黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌进行下步验证性实验。平板对峙实验显示，3种菌两两之间没有明显的抑菌圈，可以判定3株菌之间不存在拮抗关系，能够在同一体系内稳定共存。通过对目标菌株3种纤维素酶活的测定，确定了黑曲霉具有较高的内切酶和β-糖苷酶活性，绿色木霉具有较高的外切酶活性，地衣芽孢杆菌具有较高的β-糖苷酶活性。结果显示，由于地衣芽孢杆菌产生的纤维素酶是胞内酶，黑曲霉和绿色木霉降解纤维素能力要优于地衣芽孢杆菌，但地衣芽孢杆菌生长旺盛的特性让它能够更快的消耗水解产生的葡萄糖，有效的降低了产物的反馈抑制。由此看来，3株菌在降解纤维素的酶系方面能够互相补充，功能-37- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文上互相完善，达到了功能互补的条件，最终确定黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌构建混合菌剂。最后对混合菌剂的产酶能力和降解水平进行了探究。实验结果表明，按1:1:1比例构建混合菌剂的各类纤维素酶均显著高于体系内任意单一菌株的活性，在温度为30℃、初始pH值为7.0、盐浓度为1%、接种量为1.5%（v/v）、摇床转速为160rpm的条件下，混合菌剂的纤维素内切酶酶活、纤维素外切酶酶活、β-糖苷酶酶活和FPA酶活最高可分别达到6.212U/mL、4.168U/mL、12.301U/mL和3.652U/mL。我们注意到，纤维素酶的各组分酶的活性数值上都要高于总酶活，这一点从侧面证明了纤维素降解是一个复杂的过程，绝不是3种组分酶酶活的简单叠加，为探寻纤维素降解机理提供了佐证。-38- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文第4章混合菌剂的优化通过前期实验，以黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌按1:1:1比例成功构建了纤维素降解混合菌剂，并初步探究了限定条件下混合菌剂的产酶能力。本章主要是对混合菌剂的产酶能力进一步进行优化，包括对混合菌剂产酶能力的优化和对混合菌剂菌种配比的优化。本章采用单因素实验方法，选取温度、初始pH、盐度、摇床转速和接种量5个因素进行实验，探究在保持其他条件不变的情况下，各因素变化对混合菌剂产酶能力的影响，以及最优产酶的因素水平；通过正交试验方法，利用统计学分析原理，对混合菌剂菌种配比进行优化，探究混合菌剂产酶最优的菌种配比。4.1混合菌剂产酶条件的单因素优化按照2.2.5中所描述的实验方法，分别对温度、初始pH、盐度、摇床转速和接种量进行优化，所选混合菌剂的菌种配比为1:1:1。根据前期实验结果，我们选择发酵9d后取粗酶液测量其FPA酶活水平。4.1.1温度的优化本实验将温度设定为28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃6个梯度，保持其他初始条件相同，将产酶培养基置于不同温度培养，9d后测量其FPA酶活，图4-1不同温度下FPA酶活比较-39- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文每组测量重复3次，取平均值。记录FPA酶活水平，比较不同温度下的酶活，确定最优温度。实验结果如图4-1。混合菌剂发酵9d时FPA酶活随着温度的升高呈现先增大后减小的趋势，在温度为32℃时FPA酶活最大。对实验结果进行单因素方差分析，F=41.97>F0.01，不同温度下的FPA酶活相差极显著，因此确定32℃为混合菌剂的最佳产酶温度。4.1.2初始pH的优化将初始pH设定为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0共6个梯度，保持其他初始条件相同，将产酶培养基置于恒温摇床中培养，9d后测量其FPA酶活，每组测量重复3次，取平均值。记录FPA酶活水平，比较9d后不同初始pH条件下的FPA酶活，确定最优初始pH。实验结果如图4-2。图4-2不同初始pH下FPA酶活比较实验结果可知，随着初始pH的不断增加，混合菌剂的FPA酶活呈缓慢提高后下降的趋势，在pH为8.0时FPA酶活达到最大。对实验数据进行单因素方差分析，F=28.73>F0.01，初始pH对FPA酶活的影响极显著。因此可以确定混合菌剂的最优产酶初始pH为8.0。4.1.3盐度的优化将盐度设定为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%共5个梯度，保持其他初始条件相同，比较9d时不同盐度下的FPA酶活，确定最优盐度。实验结果如图4-3。-40- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文从实验结果来看，混合菌剂的FPA酶活在盐度为1%时取得最大值，随后随着盐度增加，FPA酶活水平直线下降。对实验数据进行单因素方差分析，可以看出F=72.73>F0.01，盐度对混合菌剂的产酶能力影响极显著，因此可以确定最优产酶盐度为1%。图4-3不同盐度下FPA酶活比较4.1.4摇床转速的优化将摇床转速设定为120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm共5个梯度，保持其他初始条件相同，将产酶培养基置于恒温摇床中培养，9d后测量其FPA酶活，每组测量重复3次，取平均值。记录FPA酶活水平，比较不同摇床转速下的FPA酶活，确定最优摇床转速，如图4-4。图4-4不同摇床转速下FPA酶活比较-41- 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文实验结果表明，摇床转速在160rpm时，混合菌剂有更高的FPA酶活，但前后比较来看优势并不明显，对数据进行方差分析，来确定该因素是否显著。从方差分析结果来看，F=2.57
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