硫酸乙酰肝素及其硫酸化酶对干细胞和肿瘤细胞分转化的作用研究

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1、分类号密级博士学位论文题目：硫酸乙酰肝素及其硫酸化酶对干细胞和肿瘤细胞分/转化的作用研究英文并列题目：Studyontherolesofheparansulfateanditssulfatingenzymesinstemcellandtumorcelldifferentiation/transformation研究生：赵善成专业：发酵工程研究方向：生物制药导师：陈敬华教授指导小组成员：陈荆晓副教授学位授予日期：二○一五年六月十九日答辩委员会主席：金坚江南大学地址：无锡市蠡湖大道1800号二○一五年六月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指

2、导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。签名：各多$日期：2^〇丨（关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手

3、段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。签名：导师签名:[4-_________日期：^摘要摘要硫酸乙酰肝素（heparansulfate,HS）是一种由糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖二糖重复单元组成的线性硫酸化糖胺聚糖，作为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的侧链存在于细胞膜和细胞外基质之中，可与多种生长因子、趋化因子、形态发生素、细胞外基质蛋白等多种类型的蛋白质相互作用，介导细胞信号转导，参与干细胞分化、肿瘤细胞侵袭转移、胚胎发育、病毒感染等多种生物学过程。研究其结构特征及其修饰酶与生物学功能的相关

4、性，将为再生医学发展和肿瘤治疗提供新的理论基础和潜在的新的技术路线。本文以细胞的HS和硫酸化图案编码酶HS硫酸基转移酶的生物学功能为研究对象，主要结果如下：1．建立干细胞分化模型，使用密度梯度离心法纯化大鼠骨髓间充质干细胞，流式细胞仪分析间充质干细胞表面干性标记的表达，使用化学诱导试剂建立了干细胞成骨分化模型，并通过碱性磷酸酶活性检测和成骨分化标志分子Runx2和Ocn的表达对模型加以确认。使用RT-PCR和Westernblot检测大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化前后的HS硫酸基转移酶表达谱。发现当间充质干细胞生长到高汇合度时，对照组和成骨培养体系里

5、都会形成细胞球。通过组织化学染色鉴定这种类型的细胞球是一种钙化的结节。在所有被检测的硫酸基转移酶中，HS6ST3的mRNA和蛋白质表达在这种钙化的细胞球中都上调表达，mRNA相对表达水平由0.70±0.031增至2.13±0.022（p<0.05），相对蛋白表达水平由0.37±0.024增至0.91±0.058（p<0.05）；使用RNA干扰技术建立了HS6ST3敲减的骨髓间充质干细胞，这些细胞在成骨分化时的碱性磷酸酶的相对酶活由空白诱导组2.27±0.163降至干扰诱导组1.29±0.146（p<0.05），成骨标志分子Runx2和Ocn的表达水

6、平也显著降低，mRNA相对表达水平分别由0.88±0.064降至0.26±0.025，0.92±0.080降至0.42±0.036（p<0.05），表明HS6ST3是一个与干细胞成骨分化有关的候选酶基因。2．建立肿瘤细胞诱导分化和恶性转化模型，使用全反式维甲酸诱导骨髓异常增生综合症SKM-1细胞株的粒细胞系分化，TGF-1诱导非小细胞肺癌细胞株A549的上皮—间充质转化。发现SKM-1白血病细胞向粒细胞系分化过程中HS2-O位硫酸基转移酶（HS2ST1）在mRNA和蛋白质表达水平都下调，HS2ST1的mRNA相对表达水平由0.93±0.057下降

7、到0.32±0.015和0.27±0.017（p<0.05），HS2ST1蛋白的相对表达水平由2.06±0.161下降到0.72±0.047和0.41±0.034（p<0.05），呈现ATRA剂量依赖方式；而在A549细胞上皮—间充质转换过程中HS（氨基葡萄糖）3-O位硫酸基转移酶3A（HS3ST3A）的mRNA和蛋白质表达水平下调，HS3ST3A的mRNA相对表达水平由1.67±0.062分别下降到I摘要0.92±0.037，0.67±0.029和0.33±0.044（p<0.05）；HS3ST3A相对蛋白表达水平则由0.48±0.031急剧下降

8、到0.28±0.026，0.08±0.004和0.07±0.003（p<0.05），呈现TGF-1剂量依赖方式，进一步通