硫化氢通过ampk激活调控脑缺血后小胶质细胞的极化状态

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1、-SOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论文论文题目硫化氢通过AMPK激活调控脑缺血后小胶质细胞的极化状苎研究生姓名徐英秀指导教师姓名程坚专业名称神经生物学研究方向缺血性脑卒中论文提交日期2015年5月III硫化氢供体通过AMPK激活调控脑缺血后小胶质细胞的极化状态中文摘要硫化氢通过AMPK激活调控脑缺血后小胶质细胞的极化状态中文摘要研究目的：硫化氢（H2S）是重要的内源性气体信号分子。本课题组研究表明在LPS导致的中枢神经炎症模型中H2S通过AMPK（腺苷酸活化蛋白激酶）激活选择性诱导小胶质细胞另类（M2）极

2、化。我们还发现H2S供体在动物模型中抑制脑缺血后过度的中枢神经炎症，但分子机制尚不明确。基于前期研究，本课题的目的是探讨硫化氢是否在脑缺血后通过AMPK活化促进小胶质细胞M2极化，进而促进抑制枢神经炎症并脑缺血后血管新生。研究方法：收集神经元缺氧缺糖（oxygen-glucosedeprivation,OGD）处理后的细胞培养上清，以此条件上清处理BV2小胶质细胞和原代小胶质细胞模拟体内脑缺血激活小胶质细胞的体外模型；应用小鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）法建立动物缺血性脑卒中模型。利用缓释H2S供体（ADT-OH）和

3、过表达胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase,CBS）的方法研究H2S选择性诱导小胶质细胞M2极化的机制。应用WesternBlot技术检测AMPK活化（磷酸化）、CBS以及胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的表达；通过实时荧光定量PCR（Real-timeQuantitativePolymeraseChainReaction,Q-PCR）和酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）技术检测M1(促炎状态)/M2（抗炎状态）细胞因子的表达变

4、化；应用AMPK和CaMKKβ抑制剂以及siRNA技术探索H2S促进小胶质细胞M2极化是否依赖于AMPK及CaMKKβ；利用脑微血管内皮细胞（bEnd3）在基质胶上形成血管状结构的能力探讨在条件上清处理时ADT-OH是否通过小胶质细胞M2极化促进血管新生。在动物水平上，通过小鼠MCAO模型验证H2S供体对AMPK活化和M1/M2细胞代表因子的表达的影响。结果：在神经元缺氧缺糖条件上清处理BV2小胶质细胞或原代小胶质细胞建立的脑缺血激活小胶质细胞的细胞模型中，WesternBlot结果显示：与溶剂对照组(Con)和正

5、常神经元培养基（NeuronConditionmedium,NeuronCM）处理的对照组相比，经缺氧缺糖神经元条件上清处理（OGDNeuronConditionMedium,OGDNeuronCM）的小胶质细胞AMPK活化水平明显降低(P<0.05)，而ADT-OH在OGDNeuronCM处理III中文摘要硫化氢供体通过AMPK激活调控脑缺血后小胶质细胞的极化状态时显著提高小胶质细胞AMPK活化水平（P<0.05）。Q-PCR/ELISA结果显示：OGDNeuronCM导致小胶质细胞M1极化代表因子（iNOS，I

6、L-1β，IL-6，TNF-α）表达明显升高(P<0.05)；ADT-OH则下调OGDNeuronCM诱导的M1极化代表因子的表达、并显著上调OGDNeuronCM抑制的M2极化代表因子（ARG,YM1/2,IL-10）的表达(P<0.05)。这些结果表明，OGDNeuronCM导致小胶质细胞M1极化，ADT-OH在OGDNeuronCM处理时促进小胶质细胞向M2状态转化。利用神经元条件上清刺激BV2小胶质细胞后检测CBS和CSE的表达,WesternBlot和Q-PCR结果均显示：与溶剂对照组(Con)和正常神经

7、元培养基（NeuronConditionmedium,NeuronCM）处理的对照组相比，经缺氧缺糖神经元条件上清处理（OGDNeuronConditionMedium,OGDNeuronCM）的BV2小胶质细胞CBS表达水平明显降低(P<0.05)，CSE表达水平没有明显变化。在BV2小胶质细胞中过表达CBS或转染Vector（对照），无论是否存在OGDNeuronCM刺激，与转染Vector组的BV2细胞相比，过表达CBS的BV2细胞组AMPK活化水平均显著升高，同时CBS过表达组在OGDNeuronCM处理时

8、明显促进BV2细胞向M2活化状态转化(P<0.05)。此外，AMPK抑制剂和AMPKsiRNA以及CaMKKβ抑制剂均抑制ADT-OH对BV2细胞向M2状态转化的促进作用(P<0.05)。以上实验结果说明，ADT-OH通过促进AMPK活化而促使BV2细胞向M2状态转化。应用脑微血管内皮细胞（bEnd3）研究ADT-OH通过小胶质细胞M2极化对促进血管新生的作