皱纹盘鲍内参基因筛选及c型凝集素基因表达规律的研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M120101002上海海洋大学硕士学位论文皱纹盘鲍内参基因筛选及题目：C型凝集素基因表达规律的研究Studyontheselectionofreferencegenesandtheexpression英文题目：regulationofC-typelectingeneinHaliotisdiscushannai专业：水产养殖研究方向：贝类遗传姓名：王圣刘相全副研究员指导教师：韦秀梅副研究员二O一五年六月八日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风

2、。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：2105年6月9日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内

3、容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：2015年6月9日日期：2015年6月9日上海海洋大学王圣硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注孙振兴鲁东大学教授主席赵建民中科院海岸带研究所研究员委员杜荣斌烟台大学教授委员陈建强山东省海洋资源与环境研究院秘书答辩地点山东省海洋资源与环境研究院答辩日期20150609上海海洋大学硕士学位论文皱纹盘鲍内参基因筛选及C型凝集素基因

4、表达规律的研究摘要皱纹盘鲍是一种名贵的海洋经济贝类，伴随其养殖规模的扩大，出现了病害频发和种质退化等问题，制约着产业的进一步发展。通过研究免疫相关基因表达规律，探讨皱纹盘鲍免疫机制，可为提高皱纹盘鲍抗病力提供理论参考。实时荧光定量PCR技术作为一种常用的分子生物学手段，可以快速、准确和灵敏的检测免疫相关基因的表达规律，从而了解其表达量的变化，进而探讨其功能。但是，基因表达量的分析需要稳定的内参基因进行校对，所以内参基因的选择决定着实时荧光定量PCR结果的准确性。本研究选取了皱纹盘鲍β-肌动蛋白(ACT)、18

5、S核糖体RNA(18S)、细胞色素b(CYTB)、延伸因子1(EF1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白S9(S9)和微管蛋白(TUB)等7个候选基因，以实时荧光定量PCR测定了各候选基因在皱纹盘鲍不同组织、不同发育时期以及受到藤黄微球菌和鳗弧菌刺激后血细胞样品中的Ct值，利用Bestkeeper、Normfinder和Genorm等内参筛选程序分析了各基因表达的稳定性；并以筛选出来的稳定基因为内参基因，检测了皱纹盘鲍C型凝集素分别在皱纹盘鲍各组织、各发育时期以及细菌刺激后血细胞中的表达规律。

6、以内参筛选程序分析了各候选基因在皱纹盘鲍鳃、外套膜、性腺、血细胞、肌肉和肝脏等不同组织样品中的Ct值，通过Genorm和Normfinder分别分析M值和稳定值发现各候选基因稳定性由高到低为：ACT>CYTB>18S>TUB>EF1>GAP>S9；Bestkeeper分析标准差显示各候选基因稳定性由高到低为：CYTB>18S>TUB>ACT>EF1>GAP>S9。综合三种程序稳定性排序可以得出：检测某个基因在皱纹盘鲍不同组织样品中的表达时，CYTB可作为内参基因。通过实时荧光定量PCR技术获得皱纹盘鲍2细胞、

7、4细胞、8细胞、16细胞、桑葚期、原肠期，担轮幼虫、面盘幼虫、匍匐幼虫和稚鲍等不同发育时期的各候选基因的Ct值，经Genorm和Normfinder分析显示各候选基因的稳定性为ACT>CYTB>TUB＞GAP>18S>EF1>S9；Bestkeeper分析显示各候选基因稳定性为TUB>ACT>GAP>18S>CYTB>S9>EF1。由三种程序综合分析后得出：检测某个基I上海海洋大学硕士学位论文因在皱纹盘鲍不同发育时期样品中的表达时，ACT可作为内参基因。以Genorm、Normfinder和Bestkeepe

8、r分析了各候选基因在皱纹盘鲍受到不同细菌刺激后血细胞样品中的Ct值。①藤黄微球菌刺激后，Genorm和Normfinder分析得出各候选基因稳定性由高到低为ACT>CYTB>TUB>EF1>18S>GAP>S9；Bestkeeper分析得出各候选基因稳定性由高到低为TUB>CYTB>ACT>EF1>18S>GAP>S9。②鳗弧菌刺激后Genorm分析得出各候选基因的稳定性为ACT>CYTB>TUB>