甜菜黑色焦枯病毒侵染本生烟后复制场所的形态发生及诱导寄主反应的机制

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1、分类号单位代码：密级学号：博士学位论文甜菜黑色焦枯病毒侵染本生烟后复制场所的形态发生及诱导寄主反应的机制研生曹修岭指导教师李大伟教授合作指导教师张永亮副教授申请学位门类级别理学博士专业名称微生物学研究方向分子植物病毒学所在学院生物学院二零一五年六月Ph.DDissertationMorphogenesisofreplicationfactoriesandhostresponsesinBeetblackscorchv/rw^-infecltedNicotianabenthamianaPresentedtoChina

2、AgriculturalUriiversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofPhilosophyCandidate:XiulingCa6Supervisor:ProfessorDaweiLiCo-supervisor:AssociateProfessorYongliangZhangJune,2015独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中己经注明引用和致谢的内容外

3、，论文中不包含本人和其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定。本人同意中国农业大学有权保存及向国家有关部门和机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人同意中国农业大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》或《中国优秀硕士学位论文全文数据库》进行出版，并

4、享受相关权益。保密的学位论文在解密后应遵守此协议）学位论文作者签名：青时间：年月日摘要植物病毒中很大一类属于正义病毒，正义病毒在侵染过程中都会在寄主细胞的内膜系统上形成各种的复制场所以完成病毒的复制。虽然关于正义病毒复制场所的研宄已经开展了较多的工作，但是对复制场所的形成机制仍有待深入研究。本研宄以单链正义的甜菜黑色焦枯病毒为研宄材料，对其侵染本生烟后复制场所的定位、形态发生以及三维结构进行了研究，并对参与复制的未折叠蛋白反应（和相关的寄主因子进行了探宄。首先通过激光共聚焦显微镜（观察到侵染的本生烟中内质网（形成

5、了聚集体，同时透射电子显微镜（观察发现感染的细胞中内质网发生了重塑，形成了交叠卷曲状结构，并且内质网膜凹陷形成了很多小泡结构（。利用双分子荧光互补实验（也证实复合体可以特异的与聚集体共定位。此外，利用免疫胶体金分别检测的复制辅助蛋白以及中间体，结果表明可特异的定位在膜上以及小泡结构上，而可以在小泡结构上被特异的检测到。以上结果说明，侵染本生烟后形成的内质网小泡结构是的复制场所。将蛋白在本生烟叶片中瞬时表达观察结果显示表达的细胞中伴随有聚集体的形成，且与蛋白共定位。进一步观察结果表明的表达能够引起发生卷绕和聚集。与

6、此相反，在本生烟中表达编码的其他蛋白并没有看到发生上述类似的形态变化。说明蛋白是侵染过程中诱导内质网膜重塑的关键蛋白，但单独表达并不能诱导形成类似病毒侵染的复制小泡结构。通过膜浮选实验（和构建缺失突变体证明蛋白是膜锚定蛋白，其端的跨膜区不仅对于的内质网定位有决定性作用，而且对于其重塑内质网的能力也是必需的。本文还利用电子断层成像和三维重构技术对的复制场所进行了三维重构和渲染，这在植物病毒中尚属首次报道，与已报道的动物病毒在内质网上形成复制场所的三维结构相比，有其自身的特点。通过三维重构结果发现，病毒的复制小泡和胞

7、质能够通过一个直径约的小管相连通。另外，病毒诱导形成的泡包（之间也是可以连通的。此外，我们也对复制泡中的丝状结构进行了三维渲染，结果显示其形态呈现多样性。复制场所的三维结构不仅为研宄的复制提供了新的视野，也为研究其他病毒的复制场所提供了有价值的参考。本研究中，无论是通过病毒载体还是启动子表达蛋白都能够引起本生烟注射叶片发生坏死，而这种细胞坏死作用可以通过过表达蛋白来抑制，说明过表达引起的细胞坏死与寄主的未折叠蛋白反应（存在相关性。分别检测侵染本生烟后不同时间点个不同相关基因、和的表达水平，结果表明不同基因的表达调

8、控呈现时间依赖性。利用沉默通路的关键基因后在本生烟中的积累量发生明显下降，且侵染细胞中形成的内质网聚集体数量明显减少，说明在侵染过程中发挥重要作用，对维持病毒正常侵染是必须的。这也是植物病毒中首次报道病毒复制辅助蛋白可以诱发。最后’对复制过程中所需的寄主因子进行了研宄，初步结果表明的侵染可以诱导热激蛋白和表达量的升高，而下调和的表达后能够严重影响在本生烟中的复制。后续利用