玛瑙红樱桃离体培养及体细胞无性系遗传变异

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贵州大学2015届硕士研究生学位论文玛瑙红樱桃离体培养及体细胞无性系遗传变异学科专业：林木遗传育种研究方向：林木生物技术与遗传育种导师：文晓鹏教授研究生：田田中国﹒贵州﹒贵阳2015年5月1 目录摘要...........................................................................................................................................................5Abstract......................................................................................................................................................7缩略词表...................................................................................................................................................9第一章前言.............................................................................................................................................101.课题的提出..........................................................................................................................................102.研究进展............................................................................................................................................112.1樱桃离体培养研究进展...............................................................................................................112.1.1离体培养材料的选择............................................................................................................112.1.2离体快繁.................................................................................................................................132.2离体培养的体细胞无性系遗传变异及检测方法.......................................................................132.2.1影响体细胞无性系遗传变异的类型....................................................................................142.2.2影响体细胞无性系遗传变异的因素....................................................................................162.2.3影响体细胞无性系遗传变异的检测方法............................................................................173．本研究的目的和内容........................................................................................................................203.1研究目的.......................................................................................................................................203.2研究内容.......................................................................................................................................21第二章玛瑙红樱桃的离体快繁及遗传变异的分子检测......................................................................221.玛瑙红樱桃无菌体系的建立............................................................................................................221.1实验材料.......................................................................................................................................221.2实验方法.......................................................................................................................................221.2.1无菌系的建立.........................................................................................................................221.2.2组培苗的增殖.......................................................................................................................241.2.3激素对组培苗壮苗及生根的影响.......................................................................................251.2.4组培苗的炼苗及移栽............................................................................................................261.2.5主要统计项目........................................................................................................................262．组培苗的ISSR检测.........................................................................................................................272.1实验材料与试剂...........................................................................................................................272.1.1实验材料.................................................................................................................................272.1.2实验主要试剂.........................................................................................................................272 2.1.3实验主要仪器.........................................................................................................................272.1.4实验主要试剂配置.................................................................................................................282.2ISSR检测实验方法......................................................................................................................282.2.1组培材料的DNA提取.........................................................................................................282.2.2DNA纯度检测.......................................................................................................................302.2.3PCR扩增................................................................................................................................302.2.4琼脂糖凝胶电泳检测............................................................................................................332.2.5条带统计与分析....................................................................................................................333．组培苗的MSAP检测.......................................................................................................................333.1.1实验材料.................................................................................................................................333.1.2实验主要试剂.........................................................................................................................333.1.3实验主要仪器.........................................................................................................................343.1.4实验主要试剂配置.................................................................................................................343.2.1组培材料的DNA提取及检测.............................................................................................353.2.2基因组DNA双酶切..............................................................................................................353.2.3接头合成................................................................................................................................363.2.4连接反应................................................................................................................................363.2.5预扩增....................................................................................................................................373.2.6选择性扩增............................................................................................................................383.2.7凝胶制备................................................................................................................................393.2.8PAGE凝胶电泳.....................................................................................................................403.2.9银染显色................................................................................................................................403.2.10条带统计与分析..................................................................................................................414．结果与分析.......................................................................................................................................424.1玛瑙红樱桃无菌系的建立...............................................................................................................424.1.1外植体及灭菌方式对萌发率及污染率的影响...................................................................424.1.2不同激素对组培苗增殖的影响............................................................................................434.1.3不同激素对组培苗壮苗及生根的影响................................................................................454.1.4炼苗及移栽............................................................................................................................464.2体细胞无性系变异的ISSR检测....................................................................................................463 4.2.1DNA提取...............................................................................................................................464.2.2PCR扩增................................................................................................................................474.2.3统计结果................................................................................................................................484.3离体材料的MSAP检测..................................................................................................................484.3.1基因组DNA的酶切与连接.................................................................................................484.3.2选择性扩增.............................................................................................................................494.3.3PAGE凝胶制备.....................................................................................................................494.3.4银染显色................................................................................................................................494.3.5统计结果................................................................................................................................505．讨论...................................................................................................................................................515.1玛瑙红樱桃的无菌系体系的建立...................................................................................................515.2组培苗的体细胞无性系变异...........................................................................................................525.3玛瑙红樱桃组培苗甲基化变化.......................................................................................................526．结论...................................................................................................................................................53致谢.........................................................................................................................................................55参考文献.................................................................................................................................................56附录.........................................................................................................................................................64图版及说明.............................................................................................................................................65原创性声明.............................................................................................................................................664 玛瑙红樱桃离体培养及体细胞无性系遗传变异摘要本文以贵州玛瑙红樱桃为材料，在离体快繁及离体材料的遗传变异检测、甲基化分析等方面进行了研究，旨在建立其离体快繁、微茎尖培养体系，获得遗传稳定的玛瑙红樱桃组培苗，为该品种的工厂化育苗，离体脱毒奠定技术和理论基础。取得了以下主要成果：1．玛瑙红樱桃休眠芽离体培养技术的建立选用贵州玛瑙红樱桃休眠芽为外植体，将其鳞片剥除后滴加两滴吐温-80，用0.1%升汞进行不同时间的灭菌处理，再用无菌水冲洗数次，将已灭菌的休眠芽接种在MS+1.0mg/LGA+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LIBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂（pH=6.2）培养基上，诱导休眠芽萌发，得出最佳灭菌方式为，0.1%升汞滴加2滴吐温80灭菌10min，其污染率为：48%，萌发率为：22%；休眠芽30-40d后萌发，将其转接到MS+1.0mg/LKT+1.0mg/LGA+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LIBA培养基上进行快繁培养。最佳增殖培养基为MS+1.0mg/LKT+1.5mg/LGA+0.1mg/L6-BA+0.5mg/LIBA，增值系数达到11.5；生根培养基中有3种处理较为理想：MS+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，MS+0.3mg/LIBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，MS+0.2mg/LIAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂生根率均能达到75%，长势健康，叶片大，呈深绿色，主根粗壮且须根较多，GA3对玛瑙红樱桃的生根没有显著的影响。2．离体材料遗传变异及ISSR分子检测利用21条ISSR引物对玛瑙红樱桃第1至第8代组培苗叶片基因组DNA进行ISSR检测，21条引物在继代8代内24个株系的DNA基因组进行检测，因此在引物检测范围内，玛瑙红樱桃在第8代内利用ISSR检测，没有发生变异。3．离体材料表观遗传变异及MSAP检测利用17对选择性扩增引物，对第1代至第8代组培苗基因组DNA进行选择性扩增，得到的条带进行统计分析。从第1代至第8代，共扩增出5990条带，其中，全甲基化位点717个，半甲基化位点395个；得到各代组培苗DNA基因组半甲基化率、全甲基化率及总甲基化率，从结果可以看出，随着继代次数的增加，甲基化水平逐步增高；第1至85 代组培苗，第7代组培苗总甲基化率最高为21.4%，第8代组培苗总甲基化率略微下降。关键词：玛瑙红樱桃，离体快繁，遗传变异，ISSR，MSAP6 TheMicropropagationofPrunuspseudocerasu‘Manaohong’anditsAssessmentsofGeneticVariationAbstractTosatisfytheincreasingdemandofintensiveproduction,anefficientmicropropagationsystem,geneticstabilityevaluationtotheinvitroplantletsandshootregenerationof„Manaohong’cultivarswerecarriedoutinthispresentstudy.Themainresultsareasfollow:1.TheestablishtionandoptimizationofefficientpropagationUsingdormantbudcollectedfromthestockplantsoforchardasexplants,thedormantbudweresoakedwith0.1%mercuricchlorideandtwodropsofTween-80forsterilization,followedbyrinsewithsterilewaterforseveraltiumes.Subsequently,thedormantbudswreesterilizedinoculatedinMurashigeandSkoogmacro-elements(MS)mediumcontainingthecombinationof1.0mg/LGA3,1.0mg/L6-BAand0.5mg/LIBA(pH=6.2)forasepticestablishmenttoinduceddormantbudsgermination.Thepollutionratewas48%,thegerminationratewas22%.Fifteentotwentydayslater,dormantbudssprouted.ThenturnedthemtothenewmediumMS+1.0mg/LKT+1.0mg/LGA+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LIBAcultured30days.AccordingtotheorthogonalexperimentscreenedthebestmultiplicationculturemediumisMS+1.0mg/LKT+1.5mg/LGA+0.1mg/L6-BA+0.5mg/LIBA,multiplicationcoefficientreached11.5.Inoculatedthemultiplicationseedlingsintothreedifferentkindsofmedium,MS+0.2mg/LIBA+30g/LSucrose+7g/LArgar，MS+0.3mg/LIBA+30g/LSucrose+7g/LArgar，MS+0.2mg/LIAA+30g/LSucrose+7g/LArgar，pH(6.0-6.2),rootingratesare75%,growingwell,taprootsarestoutandfibrousrootsarerich.ExperimentsshowthattheGA3hasnosignificantimpactonshootsrooting.2.GeneticvariationdetectionforinvirtromaterialandISSRmolecularmarkerththByusing21ISSRprimerstoinvestigatetheseedlingsof1to8leavesgenomeDNAthroughISSRmolecularmaker.Further,ISSRmarkersamplifiedwith21primerswerealsoadoptedtoassessthesomaclonalvariationof24invitroshootsrandomlyselectedfromtheth8cycleoftransfer.NoaberrantDNAmarkerwasinvestigated,indaicatingthat,forthemakers7 tested,nogeneticvariationwasdetectedamonginvitroshootsthathadbeenmultipliedasmanyas8cycleviaorganogenesis.3.EpigeneticvariationdetectionforinvirtromaterialandMSAPmolecularmarkerththByusing17pairsselevtive-amplilficationprimerstoinvestigatetheseedlingsof1to8thleavesgenomeDNAthroughMSAPmolecularmaker.In8cyclesshootshas5990bandswerecreated,hasfull-methylationbands717,hashemi-methylationbands395,obtainedallcycleshootsfull-methylationration,hemi-methylationrationandtotal-methylationration.FromtheresultcaninferthatDNAmethylationrationof„Manaohong‟increasedwiththetimesofthcultivation.Inthe8cycle,hemi-methylationrationis8.0%,full-methylationrationis12.5%,total-methylationrationis20.5%.KeyWords:Prunuspseudocerasu„Manaohong’，Micropropagation，invitrovariation，ISSR,MSAP8 缩略词表缩写英文名中文意义IAA3-indoleaceticacid吲哚乙酸IBA3-indolebutyricacid吲哚丁酸NAANapthaleneaceticacid萘乙酸BA6-Benzyladenine6-苄基腺嘌呤KTKinetin激动素GAGibberelin赤霉素T-80Tween80失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚MSMurashigeandSkoogmediumMS培养基DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸TrisTrihydroxymethylaminomethane三羟基氨基甲烷EDTAEthylenediaminetetraceticacid乙二胺四乙酸APSAmmoniumPersulphate过硫酸铵TEMEDN,N,N,N-tetramethyiethylenediaminN,N,N,N-四甲基乙二胺TAETris,aceticacid,EDTAbufferTris，乙酸，EDTA缓冲液TBETris,boricacid,EDTAbufferTris，硼酸，EDTA缓冲液HPLCHighPerformanceLiquidChromatography高效液相色谱DHPLCDenaturingHighPerformanceLiquidChromatography变性高效液相色谱MSPMethylationSpecificPCR甲基化特异性PCRAFLPAmplifiedFragmentLengthPolymorphism扩增片段长度多态性SSRsimplesequencerepeat简单重复序列ISSRInter-simpleSequenceRepeat简单重复序列间扩增MSAPMethylationsensitiveamplificationolymorphism甲基化敏感扩增多态性9 第一章前言1.课题的提出玛瑙红是在贵州省纳雍县库东关乡选育的樱桃新品种，在贵州省毕节市，果实4月中下旬成熟，果实发育期45-50d，属早熟品种。目前该品种在贵州省毕节市栽植面积已超2过1400hm，云南、重庆、浙江等省、市均已引种种植；玛瑙红樱桃的果实椭圆形，果柄长4.2cm，不易脱落，平均单果重4.3g，最大单果重6.9g果实鲜红色；酸甜适中，风味佳；可溶性固形物含量15.8%，可溶性糖含量11.9%，可滴定酸含量0.5%，维生素C含量225.8mg/kg，常温下可贮藏4d（陈祖瑶等，2013）。植株幼树生长旺盛，成年树萌芽率强，成枝力弱，1年可抽梢3次，品质优良，自花结实，早熟丰产，定植第2年开始初花2试果，第3年为初果期，第5年进入盛果期，产量可达650-700kg/667m。具有较强的抗寒性，玛瑙红樱桃品种较抗旱、耐瘠薄，抗病虫害能力较强，主要病虫害为蚜虫、红蜘蛛和流胶病（张军等，2012）。但是在种植玛瑙红的过程中也存在一些问题使得玛瑙红的大面积栽植受到阻碍，玛瑙红的主要繁殖方式常采用高枝压条的方式繁殖，其方法繁殖系数低，大大减慢了玛瑙红的种植速度；且由于近些年栽培的技术和管理不当，使得玛瑙红植株感染多种病毒病，感染病毒病植株面积扩大，且传播极快，总面积极逐年扩大。由于上述原因，为了能够保存玛瑙红的优良品质、扩大其的发展及获得遗传性稳定的高品质玛瑙红樱桃苗，并且能够获得脱毒玛瑙红樱桃苗，离体保存成为一个必不可少的环节。植物组织培养技术出现于20世纪五六十年代，HenshawMorel等首次提出离体保存植物种质资源的策略（姚凤琴，2012）。离体保存在许多不能用常规种子保存的植物中得到广泛应用，并且植物种质离体基因库在种质资源遗传多样性的保持和充分利用中发挥了重要作用。其相较于田间保存有一下优点：植株基因型稳定、能够快速繁殖、受外界影响小、易于控制及便于国际间交流等（邓明华等，2008）。根据不同的保存原理，保存方法可以分为：一般保存、缓慢生长法保存和超低温保存三种保存方式（钟兰等，2009）。利用离体快繁技术获得大量无菌玛瑙红樱桃苗的同时，能够为下一步获得玛瑙红脱毒苗及其他玛瑙红樱桃的研究提供了材料保障。在进行离体培养的过程中，植物体细胞无性系变异在植物组织培养中由于各种内外因素，已经成为一种较为普遍的现象。体细胞无性系变异又分为细胞变异，主要是细胞10 内的染色体和染色体的结构发生变异；序列变异，主要包括表达的核苷酸序列上的单个碱基变化、小片段的插入或缺失及重复DNA拷贝数的变化等；表观遗传变异，表观遗传变异是细胞内原有遗传潜力在离体培养中诱导表达的结果，它包括DNA甲基化变异，转座子的激活和基因的沉默等（鲍智娟，2009）。利用体细胞无性系变异可以创造更多遗传变异及扩大可利用的种质资源范围，现已证明，无论是在有性繁殖或无性繁殖的过程中，表观遗传变异均可以传递到子代，其中变异范围包括形态学和生理生化特点的变异。植株发生变异后，具有一定的经济价值，如抗病性、矮化、抗逆性和丰产性等。现已育出许多优质高产品种，如高产水稻（高东迎等，2002）。正因为频繁的继代培养会产生离体遗传变异，所以在大量、快速地选育优质玛瑙红组培苗的同时，应该时刻监测所获苗木的遗传变异情况，以保证在一定的继代次数内能够获得遗传稳定性良好的优质苗木。2.研究进展2.1樱桃离体培养研究进展樱桃组织培养技术始于20世纪70年代末（Snir，1982；Hally和Jolivette，1983），时至今日，已可利用樱桃各个器官可以诱导形成完整的植株个体，对培养基种类，增殖、生根激素的研究均为培育无病毒、快速获得长势较为一致的苗木奠定了基础。有研究表明，利用樱桃茎尖作为外植体，有5-7%的试管苗可以诱导发生变异（张开春等，2000），利用有效变异，对选育新种具有重要意义。2.1.1离体培养材料的选择在无菌体系建立研究中，可以利用樱桃的茎尖、茎段、叶片、根尖、种子和花器官等外植体进行离体培养；在樱桃离体培养研究中，也逐步对胚培养、细胞悬浮培养和胚状体的诱导也进行了一定的研究（夏国海等，2003）。在樱桃的离体培养中，可以选择各种不同的外植体进行离体培养，建立无菌系体系。不同的离体材料的培养方式不同、培养的难易程度不同。近年来，国内外对樱桃的离体培养的外植体主要选择植株的各个器官作为离体培养的材料。11 2.1.1.1器官培养樱桃离体培养的无菌系建立，多选择植株器官进行培养。例如：对樱桃的茎尖、茎段、叶片等不同器官进行组织培养。樱桃茎尖培养，国内对茎尖培养研究自1986年，董义虎就对毛樱桃的茎尖培养进行了初步研究（董义虎等，1986），研究中对3种培养及对茎尖培养的影响进行了研究，对6种不同激素对茎尖的增殖的影响进行了研究；国外对茎尖培养的研究较早，1982年，意大利学者Ancora等（1982）将樱桃砧木的茎尖分生组织接种在培养基上，进行扩繁、生根后进行移栽，成功地获得了植株。直至近几年，不仅对不同樱桃进行了茎尖培养建立无菌系体系及研究各个激素对其生长、增殖的影响，李望望等对“红灯”樱桃的茎尖培养及增殖进行了研究（李望望等，2013）；也有研究利用茎尖的培养结合其他对茎尖的处理，从而获得樱桃脱毒苗，付宏岐等对甜樱桃进行了茎尖组培脱毒研究（付宏岐等，2005），在筛选出最适增殖、生根培养基后，并获得移栽苗，证明了0.5mm以下茎尖培养对ACLSV和PDA的脱毒率高达75.8%和78.6%。樱桃茎段培养，早在1980年Feucht和Schm对甜樱桃F12/1的茎段进行离体培养（Feucht和Schm，1980），近年对各种樱桃的研究也逐渐增多，利用茎段作为外植体建立无菌系体系也成为一个较为常见的方法，陆锦明等对甜樱桃的茎段离体培养也进行了研究（陆锦明等，2014），对春季的半木质化枝条茎段作为外植体，建立了无菌系体系，并且进行增殖、生根、移栽。樱桃叶片培养，Yang和Schm对樱桃叶片的离体培养进行了研究（Yang和Schm，1992），对叶片部位对再生能力的影响，及激素TDZ的浓度对再生率的影响均进行了研究；近年来，仍然不乏对樱桃叶片作为外植体进行无菌系建立并且获得不定芽的研究，李洪雯等对欧洲甜樱桃砧木的叶片立体再生体系的建立进行了研究（李洪雯等，2014），对不同基本培养基、激素配比等方面对离体叶片再生影响的关键因素进行了研究，并对叶片培养获得的不定芽进行了统计。2.1.1.2胚培养在樱桃胚培养中，较早时期，Lane和Cossio取甜樱桃未成熟胚进行离体培养，70%的胚可以再生植株，但是完全成熟和特别幼小的胚不能再生（Lane和Cossio，1986）；近12 期，李明等采用欧洲甜樱桃早熟优良品种“红灯”建立稳定高效的胚培养成苗的技术，从外植体的消毒、激素配比及活性炭的使用等方面对影响种胚成苗的关键因素进行了研究，结果表明，胚培养可缩短育种周期，能够提高杂交种子出苗率，并且活性炭在欧洲甜樱桃胚培养成苗过程中起着非常重要的促进作用（李明等，2014）。2.1.2离体快繁在樱桃离体快繁的过程中，由于樱桃品种不同，并且采用的外植体各不相同，对增殖、壮苗、生根等离体快繁过程中的培养基种类及激素的选择、研究各不相同，对移栽基质的选择也不同；李洪雯证明，在改良DKW培养基中的培养，比MS、WPM及QL培养及的再生效果好，在增殖培养及中的激素选择6-BA及IBA对樱桃的不定芽再生有重要作用（李洪雯等，2014）；李明对MS及6-BA、IAA、GA3及活性碳对樱桃发芽率及成苗率的影响（李明等，2014）；张先云对选定MS为基本培养及后，研究NAA及6-BA对樱桃诱导叶芽萌发的最适培养及配比，生根研究中，对1/2MS培养基及NAA对樱桃植株生根诱导的影响（张先云等，2010）；郭梁研究了不同的灭菌方式对欧洲甜樱桃的污染绿的影响，及不同培养及对樱桃成活率的影响（郭梁等，2009）；彭丽萍研究基于MS培养基上，对不同激素2，4-D、NAA分别和6-BA的组合以及叶片的不同部位、暗处理对愈伤组织诱导的影响（彭丽萍等，2010）。关于各类樱桃品种及不同外植体对对无菌系体系建立的影响，各种培养基对樱桃的生长及增殖的影响，不同激素对植株生长、增殖及生根等的影响等方面的研究有很多相关报道。2.2离体培养的体细胞无性系遗传变异及检测方法细胞学变异包括染色体数目和结构变异两方面。由于内源有丝分裂、核融合（Leeetal，1991）或染色体不分离、染色体滞后、纺锤体异常和染色体断裂等原因造成了染色体数目的整倍体变异或非整倍体变异。染色体倍数的变异已在多种植物（马国斌等，2003）中被发现。染色体结构变异包括染色体断裂、缺失、倒位和易位等的变化。染色体发生易位和缺失使得染色体出现多价体。染色体断裂和重组不仅可使断裂或重组位点处的基因及其功能丢失，而且还可以使邻近的基因功能发生变化，或使未能表达的静止基因得以表达。许多植物的组织培养过程中均发现这种变异（向凤宁等，1994；张恩让等，2004）。13 2.2.1影响体细胞无性系遗传变异的类型2.2.1.1细胞变异细胞变异是指染色体的变化，无性系再生植株的细胞变异包括染色体数目和染色体结构变异2个方面。染色体数目变异分为倍性变异和非整倍性变异，其中整倍体变异较为常见；染色体非整倍性变异，包括染色体数目的增加或减少。染色体结构变异主要发生在细胞的分裂和分化时，染色体部分片段断裂，经过修复和重新连接形成染色体缺失、倒位、易位和重复，由于染色体断裂和重组，发生位点处的基因及其功能的丢失，而且会使邻近的部分具有转录功能的基因功能发生变化，使静止基因得以表达随体断裂、染色体粘连、产生环状染色体和微核等也是较常见的结构变异。早在1984年，就有对于植物离体培养中的染色体变异进行研究。有研究利用离体培养技术，通过各种胁迫处理，明确目的性的细胞变异体的筛选，定向选择一些所期望的具有抗逆特性的细胞变异体（张建华等，2002）。2.2.1.2序列变异序列变异是指核苷酸序列中碱基的改变，其中，包括单个碱基变化、小片段的插入或缺失及重复DNA拷贝数的变化等，随着分子生物学及生物化学技术的发展，例如，核酸限制性片段长度多态性（RFLP）和随机扩增多态DNA（RAPD）分析技术的开发及应用，可知体细胞无性系变异存在着大量的序列变异。关于DNA序列研究，有研究从DNA序列水平上揭示栽培中国樱桃种质资源的遗传背景，对18个群体共154个个体的遗传多样性及其群体遗传结构进行了分析（何文等，2014），对9个野生中国樱桃群体，145个个体的叶绿体DNA部分序列变异及其遗传进行结构分析（陈涛等，2012），测定部分核果类果树的ITS基因序列，利用6个核果类果树ITS序列形成了较为全面的数据矩阵，计算出6种核果之间的遗传距离、变异，构建了桃、李、梅、杏、樱桃的系统发育树（王化坤等，2010）。各种研究，对DNA基因组的部分功能基因进行DNA序列的研究，可得出其变异结果，并对各种遗传变异、新品种育种问题的解决奠定了一定的基础，提供了理论依据。14 2.2.1.3表观遗传变异表观遗传变异不是改变基因的DNA序列，但可以通过有丝分裂或减数分裂将性状稳定地遗传给子代，其中主要包括组蛋白修饰、DNA甲基化和miRNA（邢世岩等，2009）。其中，DNA甲基化对生物体生命活动重要的调节作用，根据已有的研究结果，几乎所有的生物体内均存在表观遗传调节现象，并且几乎所有的生命活动均有表观遗传调节的参与(董玉玮等，2005)。在这些表观遗传调控当中，DNA甲基化的作用最为重要，对DNA甲基化的研究目前已成为表观遗传学研究热点(王霞等，2008)。利用表观遗传变异现象，应用于植物的各种领域。有研究利用植物的远缘杂交、多倍体变化及胁迫，使植物出现表观遗传变异，将其应用于物改良（江静等,2014），木本植物表观遗传学研究将为林木遗传育种、转基因树本的发展提供更多的理论依据和技术支持（魏华丽等，2009）。2.2.1.3.1DNA甲基化变异1939年，DNA甲基化首次被提出（DNA甲基化变异是指DNA甲基化水平的改变）表观遗传学的研究也随之越来越受到重视。DNA甲基化是一种表观遗传修饰，简单的说，是将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应。并且，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。生物中的DNA基因组序列中，CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，由于它在基因组中分布不均匀，故其存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域。分子生物学研究证明，几乎所有生物的基因组中均存在DNA甲基化现象，并且DNA甲基化在基因表达调控中起到不可或缺的作用植物DNA呈现高度甲基化的状态。现研究中，大量DNA甲基化涉及到了包括生长发育（刘茜阳等，2014）、胁迫响应（王迪等，2008）、病理与死亡（黄冬梅等，2014）、转座控制等生物体所有的生命活动，并发挥重要调控作用(郑小梅等，2009)。有研究揭示了几种草莓品种的微繁殖能够导致表观遗传变异，以佐贺清香和全明星两种草莓品种为试材，证明了微繁殖能够导致草莓表观遗传变异，在草莓的生物学性状和生理生化指标上均发生了变化，且与普通苗在物候期上没有明显差异，在叶片形态及发育上也没有明显差异（张馨宇等，2006）。15 2.2.1.3.2转座子的激活转座子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置，现在发现的转座因子根据它们转座的机理不同可分为两类：转座子，其转座方式是从DNA到DNA在转座酶的作用下从原位置解离，并整合到新的位置而达到转座的目的；另一类称为逆转录转座子，其转座需要RNA为中介，即先转录为RNA再经逆转录而使其在染色体上发生移位。2.2.1.3.3基因的沉默基因沉默是指生物体中特定基因不表达，基因沉默的结果是可逆的。有研究表明部分植物存在表滚遗传变异，其基因沉默在作物的商品化生产具有严重的阻碍，经济效益降低，为了解决基因沉默对此造成的影响，对基因沉默机理进行了研究（王忠华等，2001）。2.2.2影响体细胞无性系遗传变异的因素2.2.2.1外植体类型不同的物种或同一物种的不同品种或同一品种的不同器官，其再生植株的变异频率有很大差别。对水稻（赵成章等，1990）等的研究结果都证明了这种观点，其原因可能与不同材料的背景以及基因组对外界因子的敏感程度有关（朱至清等，2003）。有些植物材料具有嵌合现象，多数情况下这种遗传差异并不表现在形态特征上，但若选作外植体诱导愈伤组织，随后再生的植株就会发生性状分离。一般情况下从茎尖、茎段、体细胞胚发生的植株不变异或极低。2.2.2.2培养条件培养基种类，激素的组成和含量对体细胞无性系变异有着重要的影响，特别是2,4-D影响极大（朱至清等，2003）。生长素和细胞分裂素的比例可以影响或决定体细胞的启动分裂方式，从而影响变异的频率。16 2.2.2.3培养时间多数体细胞无性系变异是在组织培养过程中产生的，多数研究证明体细胞无性系变异在培养过程中不断产生，变异率随着继代次数和培养时间的增加而增加（刁现民和孙敬三，1999；文晓鹏和邓秀新，2003），但也有人认为在培养后期观察到的变异实际上发生在培养早期，只是由于取样原因而没有在早期检测到（PeschkeandPhillips，1992），早期的突变可以随培养时间延长而积累在后期表现。2.2.2.4再生方式植物离体再生的方式有无菌短枝型、丛生芽增殖型、器官发生型、胚状体发生型和原球茎型五种，一般通过愈伤组织诱导的不定芽和悬浮培养，再生苗变异率较高。有研究指出，由于只有未经过畸变的细胞才能形成胚状体，所以经体细胞胚状体发生形成的植株不会发生变异，但在烟草、小麦和玉米等由体细胞胚胎发生形成的植株中却检测到变异（朱至清等，2003）。2.2.3体细胞无性系遗传变异的检测方法2.2.3.1形态学形态学检测是最常用、最简单的检测离体培养材料遗传稳定性的方法。变异可以表现在株高、叶形、果实、花形、花瓣数、花色等植株外观形态上的不同，因此只要对形态学指标进行观察，即可检测出是否发生了变异。有研究对我国特有珍稀濒危保护植物云南金钱槭的形态变异进行研究，检测其遗传变异的相关性（李珊等，2004）；对毛竹居群的17个形态学性状进行研究，结果表明居群间和居群内存在相对丰富的遗传差异，并且存在居群内变异大于居群间变异现象，为遗传多样性的鉴定、分类研究及种质资源收集提供理论依据（张守锋等，2007）。2.2.3.2细胞学长期的离体继代培养过程中通常会出现染色体数目、结构的变异以及染色体行为异17 常等现象。变异包括整倍体变异、非整倍体变异、混倍体，及类减数分裂行为。在研究中标明，仲彬草属植物具有非常丰富的遗传变异，利用细胞学检测方法，对其遗传变异进行检测（曾建，2007）；利用细胞学检测方法，对棉花体细胞胚胎发生及再生过程中的遗传变异进行检测（曾范昌等，2006）。2.2.3.3DNA分子标记DNA分子标记已经得到了迅速发展并被运用于分子生物学研究的各个领域，检测时直接以所测材料的DNA为样本，不受季节、环境、取样部位和时期的限制，也不存在形态学表现与否的问题。其方法快速、简便及高效，越来越多的遗传变异检测均使用分子标记。①RAPD检测技术RAPD技术是建立在PCR基础之上的一种对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。RAPD技术得原理是以基因组DNA为模板，单个人工合成的随机多态核苷酸序列（通常为10个碱基对）为引物，在热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）作用下，进行PCR扩增。RAPD检测技术已经广泛运用于各种植物的品种鉴定、遗传变异检测、物种多样性分析及群体遗传变异，有研究利用RAPD分子标记技术对8个形态学相似的桑葚品种进行品种鉴定（解卫海等，2015）；有研究利用RAPD分子标记技术，对在四川西部地区的濒危植物桃儿七的7个自然种群的遗传多样性水平和遗传结构进行了分析（肖猛，2015）；利用RAPD分子技术对不同地域野生欧李及其近缘植物亲缘关系的分析（王鹏飞等，2015）。②ISSR检测ISSR(Inter-SimpleSequenceRepeat)是一种新型的分子标记，ISSR分子标记是在SSR标记基础上发展起来的一种新技术，基本原理是在SSR的5‟或3‟端加锚1-4个嘌呤或嘧啶碱基，以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增。扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳后分离出片段长度不同的条带，应用ISSR产生的条带比RAPD方法的更多。ISSR标记是一种快速、可靠、基因组丰富信息的DNA指纹技术。目前ISSR标记已广泛用于植物遗传作图、品种鉴定、遗传多样性、基因定位、进化及分子生态学研究中。ISSR通常为显性标记,呈孟德尔式遗传，具有很好的稳定性和多态性，DNA用量少，技术要求低，成本低廉，重复性高。利用ISSR技术探究不同新疆18 欧洲李种质类型间的亲缘关系（孙琪等，2015）；利用ISSR技术对观叶福禄桐遗传多样性进行分析（张国武等，2015）；利用ISSR技术对西南牡丹品种起源进行研究（李宗艳等，2015）。③AFLP检测AFLP分子检测得技术原理是基于对基因组DNA双酶切限制性片段，使用特定的双链接头与酶切片段连接，连接产物作为PCR扩增反应的模板，得到多态性片段，该技术过程复杂，且实验成本高，对操作人员技术要求也较高。利用AFLP分子标记对大麻雄性基因连锁的筛选及鉴定（郭丽等，2015）；利用AFLP队海萝野生群体遗传多样性分析（郭奕惠等，2015）。2.2.3.3DNA甲基化检测方法DNA甲基化检测及分析方法多样，按照功能的不同可大致分为两类：一类是基因组DNA化检测方法，可在基因组整体水平上对DNA甲基化状态进行检测，但不能对特异性基因或位点进行检测；另一类是特异性位点甲基化检测方法，能够检测目的序列或目的基因的甲基化状态，甲基化位置定位更加精确。其中，基因组DNA化检测方法主要包括：高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)、甲基化敏感扩增多态性法(MethylationSensitiveAmplificationPolymorphism，MSAP)等；另一类是特异性位点甲基化检测方法，主要包括：亚硫酸盐测序法(BisulfiteDNAsequencing，BSP)、甲基化特异性PCR(MethylationSpecificPCR，MSP)等。甲基化敏感扩增多态性(MethylationSensitiveAmplificationPolymorphism，MSAP)技术，该方法是基于扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP)技术而发展起来的一种经典的DNA甲基化检测方法。首先利用一对甲基化敏感的内切酶将DNA切割成片段后，加上人工合成的双链接头，然后进行扩增分析(Xiongetal，1999)。该方法常用到的内切酶组合为MSpI/HpaⅡ(识别序列CCGG)，此方法成本低廉，甲基化位点明确，结果易于分析。利用MSAP检测，对马铃薯茎尖玻璃化法超低温保存后DNA甲基化的遗传变异进行检测（王芳等，2013）；对大花蕙兰子房授粉前后基因组DNA胞嘧啶甲基化状态的MSAP分析（陈小强等，2008）；研究乙烯利处理对棉花子叶DNA表观遗传变化的甲基化敏感扩增多态性（郭宁等，2014）。19 3本研究的目的和内容3.1研究目的玛瑙红樱桃是在贵州省2011年审定的新品种，该品种丰产优质、耐贮性好，目前在贵州省大面积栽培，并推广到周边省区。在大面积生产的过程中存在一些不可忽视的问题，其繁殖系数低、病毒病传播严重，组织培养能够有效解决生产中存在的这些问题并能够快速获得大量品质优良、长势健壮的组培苗。但在组织培养过程中，由于组织培养激素、环境及继代次数对组培材料都有影响，并且广泛存在遗传变异和表观遗传变异，在表观遗传变异中，DNA甲基化是表观遗传变异的重要组成成分，尽管DNA甲基化不改变DNA的碱基序列，但具有明显的表观遗传效应，许多研究表明DNA甲基化参与了植物许多重要的生命过程，在基因表达、生长发育、抵御逆境胁迫中起着重要的调节作用。目前对植物DNA甲基化的研究只是近年来受到重视，由于DNA甲基化在调节植物生命活动中的重要性，对植物DNA甲基化的研究成为遗传学研究所关注的热点。在研究过程中发现再生植株的遗传变异和DNA甲基化在樱桃的研究中尚未有过报道。本文建立了玛瑙红樱桃离体快繁体系，并利用ISSR分子标记及MSAP检测方法对继代增殖的组培苗进行遗传变异及表观遗传变异进行检测，旨在为工厂化育苗奠定技术和理论基础。20 3.2研究内容本课题的主要研究内容如下：1）建立玛瑙红樱桃无菌系体系；2）优化离体快繁体系；3）离体材料遗传变异的ISSR检测；4）离体材料表观遗传变异DNA甲基化的MSAP检测。21 第二章玛瑙红樱桃的离体快繁及遗传变异的分子检测1.玛瑙红樱桃无菌体系的建立1.1实验材料实验材料采自贵阳市乌当区，玛瑙红樱桃枝条；一部分为3月至5月的春季枝条茎段侧芽，一部分为11月至次年2月的休眠枝条休眠芽。1.2实验方法1.2.1无菌系的建立在当地采集的玛瑙红新鲜春枝及冬季休眠枝，剪掉枝条上所有叶片减少其水分的蒸发，尽快带回实验室进行外植体的灭菌及接种。1.2.1.1外植体的选择外植体的选择对成活率的影响至关重要，外植体的不同，其生长成独立植株的能力大小不同。在本研究中，对两种不同外植体对成活率的影响进行了对比，使用性状稳定、生长健壮无病虫害的成年植株的玛瑙红樱桃两种不同枝条叶芽作为外植体：春枝叶芽（萌发能力强）、冬季休眠芽（营养物质贮存丰富）。1.2.1.2不同外植体的灭菌方式春枝预处理：将采集回来的玛瑙红樱桃春枝用洗洁精水洗涤后，用清水冲洗干净，用灭菌后的剪子将枝条靠近顶端带有饱满叶芽的枝条剪为常为1-2cm左右的茎段装入已灭菌的玻璃广口瓶中用无菌水冲洗数遍后备用。休眠枝预处理：将采集回来的玛瑙红樱桃休眠枝用洗洁精水洗涤后，用清水冲洗干22 净，用以灭菌的尖头镊子将饱满休眠叶芽外层的鳞片剥掉数层，再用灭菌后的剪子将枝条靠近顶端带有饱满侧芽的枝条剪为常为0.5-1cm左右的茎段，装入已灭菌的玻璃广口瓶中用无菌水冲洗数遍后备用。将外植体处理好后，根据不同外植体对其进行不同灭菌方式：春季叶芽灭菌方式：75%酒精灭菌10s后，滴加2滴Tween-80，并倒入0.1%升汞进行不同时间的灭菌处理（表1），再用无菌水反复清洗4-5次，用滤纸将其表面的水分吸干，再用已灭菌的手术刀将与升汞接触后的创伤面切除，每个处理灭菌50个春芽，后接种到高压灭菌后的培养基上进行培养。表1不同灭菌处理的实验设计Table1Thedesignofdifferentdisinfectiontreatment处理号处理方式处理时间（min）TreatmentsProcessingmodeProcessingtime175%酒精10s+0.1%升汞+2滴Tween-806275%酒精10s+0.1%升汞+2滴Tween-808375%酒精10s+0.1%升汞+2滴Tween-8010475%酒精10s+0.1%升汞+2滴Tween-8012575%酒精10s+0.1%升汞+2滴Tween-801460.1%升汞+2滴Tween-80670.1%升汞+2滴Tween-80880.1%升汞+2滴Tween-801090.1%升汞+2滴Tween-8012100.1%升汞+2滴Tween-8014休眠芽灭菌方式：75%酒精灭菌10s后，滴加2滴Tween-80，并倒入0.1%升汞进行不同时间的灭菌处理（表2），再用无菌水反复清洗4-5次，用滤纸将其表面的水分吸干，再用已灭菌的手术刀将与升汞接触后的创伤面切除，每个处理灭菌50个休眠芽，后接种到高压灭菌后的培养基上进行培养。23 表2不同灭菌处理的实验设计Table2Thedesignofdifferentdisinfectiontreatment处理号处理方式处理时间（min）TreatmentsProcessingmodeProcessingtime175%酒精10s+0.1%升汞+2滴Tween-804275%酒精10s+0.1%升汞+2滴Tween-806375%酒精10s+0.1%升汞+2滴Tween-808475%酒精10s+0.1%升汞+2滴Tween-8010575%酒精10s+0.1%升汞+2滴Tween-801260.1%升汞+2滴Tween-80470.1%升汞+2滴Tween-80680.1%升汞+2滴Tween-80890.1%升汞+2滴Tween-8010100.1%升汞+2滴Tween-80122春枝叶芽及冬季休眠芽培养条件均为：25±2℃，光强33μmol/m·s，每日光照12h。10d后统计污染率、褐化率，30d后统计萌芽率。1.2.2组培苗的增殖将萌发后的外植体转入MS空白培养基中进行培养，培养一段时间后，将长势一致的组培苗转入不同的增殖培养基中进行增殖培养。设置KT、IBA、6-BA及GA，共4个因素，3个水平进行正交试验，共9个处理（表3），每个处理接种4株长势相同的组培苗，每个处理重复4次，50d后统计增殖率，并观察植株生长状况。24 表3激素浓度对试管苗增殖影响的实验设计Table3ThedesignforeffectsofPlantgrowthregulators(PGRs)concentrationonpropagationefficiencyofinvitroshoots处理号KT（mg/L）6-BA（mg/L）IBA（mg/L）GA（mg/L）CK000010.50.10.10.520.50.50.51.030.51.01.01.541.00.10.51.551.00.51.00.561.01.00.11.071.50.11.01.081.50.50.11.591.51.00.50.51.2.3激素对组培苗壮苗及生根的影响将长势良好、一致的增殖苗转至壮苗生根培养基中进行壮苗、生根培养；根据IAA、NAA、IBA对樱桃生根均有影响，且GA3对樱桃的生根也具有一定的影响，生根培养基根据各因素设置3个水平，共设置27个处理（表4），每个处理接种4株长势一致的组培苗，每个处理重复4次；45d后统计其生根率、根长、根数及长势状况。25 表4生根壮苗实验设计Table4ThedesignforeffectsofPGRsonrootgenerationofcheery处理号IBAGA3处理号IAAGA3处理号NAAGA3Treatments（mg/L）（mg/L）Treatments（mg/L）（mg/L）Treatments（mg/L）（mg/L）10.10100.10190.25020.10.5110.10.5200.250.530.21.0120.21.0210.251.040.20130.20220.5050.20.5140.20.5230.50.560.31.0150.31.0240.51.070.30160.30250.75080.30.5170.30.5260.750.590.11.0180.10270.751.01.2.4组培苗的炼苗及移栽选取根长为3cm以上且长势良好的组培苗，将组培瓶盖打开，放置在原来的培养条件下进行驯化、炼苗，2-3d后将组培苗取出，将组培苗根部培养基洗净，移栽至灭菌后的基质中，并浇透水并喷施少量浓度的百菌清（0.1%），45d后观察植株生长状况，并统计其成活率。1.2.5主要统计项目1）污染率污染率=污染数/原接种数×100%2）褐化率褐化率=褐化数/原接种数×100%3）萌芽率萌芽率=萌芽数/原接种数×100%4）增殖系数增值系数=萌发腋芽数/原接种组培苗数×100%5）生根率生根率=生根植株数/接种组培苗数×100%6）平均根数平均根数=总根数/株数×100%7）平均根长平均根长=总根长/株数×100%实验数据利用Excel进行统计处理，利用DPS数据分析软件对各处理的增值系数、26 根长及根数进行方差分析，各处理平均值采用Duncan‟s多重比较进行检验。生根率为生根植株数与接种组培苗数之比，并用SPSS18.0的t检验进行生根率的显著性分析。2．组培苗的ISSR检测2.1实验材料与试剂2.1.1实验材料在增殖培养中获得的第1代至第8代组培苗中选取长势良好的组培苗，培养基为MS+1.0mg/LKT+0.1mg/L6-BA+0.5mg/LIBA+1.5mg/LGA3+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH（6.0-6.2）。每45-50d继代一次，继代8代；每次收集于离心管中，经液氮速冻后，置于−80℃超低温冰箱进行保存。2.1.2实验主要试剂无水乙醇成都金山化学试剂有限公司Tris美国Sigma公司EDTA美国Sigma公司冰醋酸重庆川东化工（集团）有限公司琼脂粉美国Sigma公司GoldView北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司2.1.3实验主要仪器精密电子天平美国双杰兄弟有限公司实验是超纯水机（DW100）上海和泰仪器有限公司磁力搅拌器上海亚荣生化仪器厂凝胶成像系统美国Bio-rad公司高压灭菌锅上海三申公司27 高速冷冻离心机（DK-3450）美国Sigma公司PCR仪美国Bio-rad公司电泳仪（DYY-6C）北京市六一仪器厂微波炉广东美的电器股份有限公司Hair超低温冰箱（DW-86L626）青岛海尔特种电器有限公司2.1.4实验主要试剂配置1．0.50mol/LEDTA溶液EDTA-Na2·H2O93.05gddH2O500.00ml称取EDTA-Na2·H2O后，加入适量的ddH2O充分溶解后，用NaOH调pH值至8.0，加ddH2O定溶至500ml，高压灭菌，4℃保存。2．TAE电泳缓冲液（50×）0.5mol/LEDTA(pH=8.0)100.00mlTris-base242.00g冰醋酸57.10ml称取Tris-base后，加入适量ddH2O在水浴中充分溶解，加入其它溶液后，再加入ddH2O定溶至1L。电泳时，将50×TAE电泳缓冲液稀释成1×TAE电泳缓冲液。3．2.0%琼脂糖凝胶配置琼脂糖2.00g1×TAE100.00ml称取0.20g琼脂糖，并加入1×TAE10.00ml于三角瓶中，在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解后，冷却至60℃左右，倒制胶板。2.2ISSR检测实验方法2.2.1组培材料的DNA提取从离体培养的每一代长势相同的组培苗中，第1代至第8代中，各代组培苗中随机选取3株玛瑙红樱桃组培材料进行DNA提取。28 以北京天根公司植物基因组DNA提取试剂盒（目录号：DP320）提取玛瑙红樱桃植物基因组DNA。1）处理材料：取植物新鲜组织100mg，加入液氮充分研磨，加入400μl缓冲液LP1和6μlRNAaseA（10mg/ml），漩涡震荡1min，室温水平放置10min，使样品与缓冲液的接触面积为最大。2）加入130μl缓冲液PL2，充分混匀，旋涡震荡1min。3）在转速为12,000rmp（-13,400×g）下离心5min，将上清液移至新的离心管中。4）加入1.5倍体积的缓冲液LP3（例如500μl的上清液加750μl缓冲液PL3），立即充分震荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀；注意：使用前先在缓冲液PL3中加入相应量的无水乙醇5）将上一步所得溶液及絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入新的收集管中），12,000rpm（-13,400×g）离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放回入收集管中。6）向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，在转速为12,000rpm（-13,400×g）下离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。注意：PW使用前先检查是否加入无水乙醇；如果吸附柱膜呈绿色，向吸附柱CB3中加入500μl无水乙醇，12,000rpm（-13,400×g）离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7）重复操作步骤6。8）将吸附柱CB3放回收集管中，在转速12,000rmp（-13,400×g）下离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中的漂洗液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残留的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应，酶切、PCR等实验。9）将吸附柱CB3转放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，在转速12,000rmp（-13,400×g）下离心2min，收集到离心管中。（注意：为增加DNA得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rmp（-13,400×g）离心2min。洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱29 液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。）提取得到的DNA保存在−20℃保存待用，防止DNA降解。2.2.2DNA纯度检测1）利用超微量分光光度计2）利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品：采用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳（GoldView0.5μg/ml），将2μl的DNA样品进行电泳检测，电泳完毕后在紫外凝胶成像系统下检测DNA的纯度、污染及降解情况。3）利用紫外分光光度法，测定DNA260nm及280nm的吸收值，根据A260/A280值，能够大致判断DNA的纯度。2.2.3PCR扩增将提取检测后的DNA作为ISSR-PCR扩增模板，用于ISSR检测的为随机引物84条，扩增反应体系如下（表5）：表5ISSR-PCR扩增的反应体系Table5ReactionsystemofISSR-PCR成分体积(μl)ISSR引物0.8DNA模板1.0Mix5.0ddH2O3.2总体积10将上述反应液充分混匀后，进行PCR扩增，其中，根据不同引物的退火温度，PCR扩增的退火温度也不同，实验将每个引物的退火温度设定在Tm±5℃范围内，每个引物设定3个退火温度，筛选扩增引物（即每个引物设定3个退火温度进行ISSR-PCR扩增，选出多态性较好、条带较多的引物退火温度，最后再利用于各代组培苗的遗传变异检测）；ISSR-PCR扩增反应程序如下（表6）：30 表6ISSR-PCR扩增程序Table6ReactionprocedureofISSR-PCR步骤温度(℃)时间StepsTemperatureDuration预变性945min变性9440s退火Tm±5（根据引物确定）60s35cycles延伸7260s延伸727min保存4∞其中，RCR反应引物由上海生工合成（表7）。表7用于ISSR扩增的84个随机引物及其序列Table7ThearbitraryprimersandtheirSequenceareusedforISSRanalysis引物引物序列引物引物序列PrimersSquencePrimersSquenceM01CACACACACACAR849GTGTGTGTGTGTGTGTYAM02CACCACACACARY850GTGTGTGTGTGTGTGTYCM03CACCACACACARg851GTGTGTGTGTGTGTGTYGM04gTgTgTgTgTgTYR852TCTCTCTCTCTCTCTCRAM05gCTgCTgCTgCTY853TCTCTCTCTCTCTCTCRTM06AgCAgCAgCAgCY854TCTCTCTCTCTCTCTCRGM08AgCAgCAgCAgCAY856ACACACACACACACACYA807AGAGAGAGAGAGAGAGT858TGTGTGTGTGTGTGTGRT808AGAGAGAGAGAGAGAGC859TGTGTGTGTGTGTGTGRC809AGAGAGAGAGAGAGAGG860TGTGTGTGTGTGTGTGRA810GAGAGAGAGAGAGAGAT861ACCACCACCACCACCACC811GAGAGAGAGAGAGAGAC862AGCAGCAGCAGCAGCAGC812GAGAGAGAGAGAGAGAA863AGTAGTAGTAGTAGTAGT813CTCTCTCTCTCTCTCTT864ATGATGATGATGATGATG31 814CTCTCTCTCTCTCTCTA866CTCCTCCTCCTCCTCCTC815CTCTCTCTCTCTCTCTG868GAAGAAGAAGAAGAAGAA816CACACACACACACACAT869GTTGTTGTTGTTGTTGTT817CACACACACACACACAA870TGCTGCTGCTGCTGCTGC818CACACACACACACACAG872GATAGATAGATAGATA819GTGTGTGTGTGTGTGTA873GACAGACAGACAGACA820GTGTGTGTGTGTGTGTC874CCCTCCCTCCCTCCCT821GTGTGTGTGTGTGTGTT875CTAGCTAGCTAGCTAG822TCTCTCTCTCTCTCTCA876GATAGATAGACAGACA823TCTCTCTCTCTCTCTCC877TGCATGCATGCATGCA824TCTCTCTCTCTCTCTCG878GGATGGATGGATGGAT825ACACACACACACACACT880GGAGAGGAGAGGAGA826ACACACACACACACACC881GGGTGGGGTGGGGTG827ACACACACACACACACG884HBHAGAGAGAGAGAGAG828TGTGTGTGTGTGTGTGA885BHBGAGAGAGAGAGAGA829TGTGTGTGTGTGTGTGC886VDVCTCTCTCTCTCTCT830TGTGTGTGTGTGTGTGG887DVDTCTCTCTCTCTCTC834AGAGAGAGAGAGAGAGYT888BDBCACACACACACACA835AGAGAGAGAGAGAGAGYC889DBDACACACACACACAC836AGAGAGAGAGAGAGAGYA890VHVGTGTGTGTGTGTGT840GAGAGAGAGAGAGAGAYT891HVHTGTGTGTGTGTGTG841GAGAGAGAGAGAGAGAYC892TAGATCTGATATCTGAATTCCC842GAGAGAGAGAGAGAGAYG893NNNNNNNNNNNNNNN845CTCTCTCTCTCTCTCTRG895AGAGTTGGTAGCTCTTGATC846CACACACACACACACART898GATCAAGCTTNNNNNNATGTGG847CACACACACACACACARC899CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA848CACACACACACACACARG900ACTTCCCCACAGGTTAACACA其中：B=(C,G,T)(I.e.notA),D=(A,G,T)(I.e.notC),H=(A,C,T)(I.e.notG),N=(A,G,C,T),R=(A,G),Y=(C,T),V=(A,C,G)(I.e.notT)（下同）32 2.2.4琼脂糖凝胶电泳检测将ISSR-PCR扩增产物在含有GoldView（0.5μg/ml）的2.0%琼脂糖凝胶上点样5μl进行电泳，电泳条件：将1×TAE作为电泳缓冲液，电压140-150V，电流80A，1h40min-1h50min进行电泳。2.2.5条带统计与分析将ISSR-PCR电泳凝胶放置在凝胶成像系统中拍照并进行统一数据统计分析，将每个引物扩增出的每代组培苗的条带数进行统计，与母株对应引物扩增出条带数进行对比，根据条带的差异性判断其遗传变异性。3．组培苗的MSAP检测3.1实验材料与试剂3.1.1实验材料在增殖培养中获得的第1代至第8代组培苗中选取长势良好的组培苗，培养基为MS+1.0mg/LKT+0.1mg/L6-BA+0.5mg/LIBA+1.5mg/LGA3+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH（6.0-6.2）。每45-50d继代一次，继代8代；每次收集于离心管中，经液氮速冻后，置于−80℃超低温冰箱进行保存。3.1.2实验主要试剂Tris-base美国Sigma公司EDTA-Na2·H2O美国Sigma公司硼酸生工生物工程（上海）有限公司APS生工生物工程（上海）有限公司去离子甲酰胺生工生物工程（上海）有限公司二甲苯氰生工生物工程（上海）有限公司33 溴酚蓝生工生物工程（上海）有限公司40%PAGE生工生物工程（上海）有限公司尿素美国Sigma公司TEMED生工生物工程（上海）有限公司硝酸银重庆川东化工（集团）有限公司氢氧化钠重庆川东化工（集团）有限公司甲醛生工生物工程（上海）有限公司琼脂糖美国Sigma公司3.1.3实验主要仪器精密电子天平美国双杰兄弟有限公司实验是超纯水机（DW100）上海和泰仪器有限公司磁力搅拌器上海亚荣生化仪器厂凝胶成像系统美国Bio-rad有限公司高压灭菌锅上海三申公司高速冷冻离心机（DK-3450）美国Sigma公司PCR仪美国Bio-rad有限公司电泳仪（DYY-6C）北京市六一仪器厂摇床北京市六一仪器厂微波炉广东美的电器股份有限公司垂直电泳漕北京市六一仪器厂Hair超低温冰箱（DW-86L626）青岛海尔特种电器有限公司3.1.4实验主要试剂配置1．TBE（×10）缓冲液Tris-base107.80gEDTA-Na2·H2O7.44g硼酸55.00g称取Tris后，加热溶解于200mlddH2O中，再将称取后的EDTA-Na2·H2O加热34 溶解于100mlddH2O中，最后将称取后的硼酸加热溶解于400mlddH2O中；将三种溶液充分混匀后定溶至1L。2．10%APS溶液过硫酸铵0.50g称取0.50g过硫酸铵，溶解于5mlddH2O中，−20℃中避光保存。3．上样缓冲液SGB去离子甲酰胺10ml二甲苯氰10ml溴酚蓝10ml0.5mol/LEDTA-Na2(pH=8.0)200μl将配制好的上样缓冲液SGB，4℃避光保存。3.2MSAP检测实验方法3.2.1组培材料的DNA提取及检测同2.2.1、2.2.2。3.2.2基因组DNA双酶切1．EcoRⅠ酶切：EcoRⅠ进行第一步酶切反应，反应体系（表8）：表8EcoRⅠ酶切反应体系Table8EcoRⅠenzymedigestionreactionsystem成分体积10×BufferTango4μlEcoRⅠ1μlDNA400-800ngddH2O补足40μl总体积40μl酶切条件：37℃，温浴酶切3-6h；35 2．HpaⅡ和MspⅠ酶切：将EcoRⅠ酶切产物与对基因组DNA甲基化敏感性不同HpaⅡ和MspⅠ两种酶组合，进行第二步酶切，反应体系（表9）：表9HpaⅡ/MspⅠ酶切反应体系Table9HpaⅡ/MspⅠenzymedigestionreactionsystem成分体积(μl)10×BufferTango2EcoRⅠ酶切产物10HpaⅡ或MspⅠ0.25ddH2O7.75总体积20酶切条件：37℃，温浴酶切6-8h。3.2.3接头合成将接头E-I、E-II及H/M-I、H/M-II（表10）分别加入等量单链接头，使E/I/II、H/M/I/II分装于离心管中进行变性、复性后成为双链接头，变性条件：95℃变性5min，缓慢冷却至室温后，冷藏于−20℃保存中备用。表10接头及其序列Table10SequenceofadaptersonMSAP接头序列AdapterSequenceE-ICTCGTAGACTGCGTACCE-IIAATTGGTACGCAGTCH/M-IGACGATGAGTCCTGAGH/M-IICGCTCAGGACTCAT3.2.4连接反应将双酶切获得的完全酶切产物中加入两种接头，将液体轻微混匀后，在22℃条件下温浴6-8h，连接反应体系（表11）：36 表11连接反应体系Table11Linkagereactionsystem成分体积(μl)10×LigaseBuffer3完全酶切产物20E/I/II1H/M/I/II1T4Ligase0.5ddH2O4.5总体积303.2.5预扩增将上步连接反应产物作为预扩增模板，将下列预扩增引物（表12）进行预扩增反应，表12预扩增引物及序列Table12SequenceofpreselectiveprimersonMSAP预扩增引物序列PreselectiveprimersSequenceE+AGTAGACTGCGTACCAATTCAH/M+TGAGTCCTGAGCGGT预扩增反应体系（表13）：表13预扩增反应体系Table13Reactionsystemofpre-amplification成分体积(μl)连接产物2E+A2H/M+T2Mix10ddH2O4总体积2037 预扩增程序如下（表14），并将预扩增产物稀释50倍后待用。表14预扩增反应程序Table14Reactionprocedureofpre-amplilfication步骤温度(℃)时间StepsTemperatureDuration预变性942min变性9430s退火5630s35cycle延伸722min延伸7210min3.2.6选择性扩增将预扩增产物稀释50后，用作选择性扩增的模板，在20μl选择性扩增体系中加入两个选择性碱基作为选择性扩增引物（引物稀释10倍，保存于待用−20℃），引物序列见下表（表15），组合后共有81对选择性扩增引物，经过垂直电泳检测，筛选出结果稳定、多态性好的引物作为试验最终选择性扩增引物。表15选择性扩增引物及序列Table15SequenceofselectiveprimersonMSAP引物A序列引物B序列selectiveprimersSequenceselectiveprimersSequenceE+A+P1GTAGACTGCGTACCAATTCAAGH/M+T+P1GAGTCCTGAGCGGTCAE+A+P2GTAGACTGCGTACCAATTCACAH/M+T+P2GAGTCCTGAGCGGTCCE+A+P3GTAGACTGCGTACCAATTCACTH/M+T+P3GAGTCCTGAGCGGTCTE+A+P4GTAGACTGCGTACCAATTCACCH/M+T+P4GAGTCCTGAGCGGTACE+A+P5GTAGACTGCGTACCAATTCACGH/M+T+P5GAGTCCTGAGCGGTGGE+A+P6GTAGACTGCGTACCAATTCAGCH/M+T+P6GAGTCCTGAGCGGTGAE+A+P7GTAGACTGCGTACCAATTCAACH/M+T+P7GAGTCCTGAGCGGTAGE+A+P8GTAGACTGCGTACCAATTCAGAH/M+T+P8GAGTCCTGAGCGGTTAE+A+P9GTAGACTGCGTACCAATTCAATH/M+T+P9GAGTCCTGAGCGGTGT38 选择性扩增反应体系如下（表16）：表16预扩增反应体系Table16Reactionsystemofselective-amplification成分体积(μl)预扩增产物3引物A2引物B2Mix5ddH2O8总体积20选择性扩增反应程序如下表（表17）：表17选择性扩增反应程序Table17Reactionprocedureofselevtive-amplilfication步骤温度(℃)时间StepsTemperatureDuration预变性943min变性9430s退火65(reduce0.7℃percycle)30s13cycles延伸722min变性9430s退火5630s27cycles延伸722min延伸7210min3.2.7凝胶制备1．将制胶玻璃板洗干净后，用ddH2O再冲洗数遍，晾干备用；2．将晾干玻璃板组装好后，1.0%琼脂糖凝胶加热溶解后，冷却至60℃后，用于制胶板封口，待封口胶凝固后备用；3．6%变性聚丙烯酰胺凝胶制备，方法入下（表18）；39 4．灌胶后，水平插入梳子，待凝胶聚合2h后，即可点样进行电泳。表186%PAGE胶体系Table18Systemof6%PoIyacrylamideGel成分体积40%PAGE贮备液3.75ml10×TBE2.50ml尿素10.50g10%APS100.00μlTEMED18.00μlddH2O补足至25.00ml总体积25.00ml3.2.8PAGE凝胶电泳1．待凝胶聚合后，用1×TBE缓冲液将冲洗凝胶点样孔数遍，后在恒定80V电压下进行10min预电泳；2．想选择性扩增产物中加入4μl上样缓冲液SGB，均匀混合后，在97℃条件下，放入PCR仪中变性8min；3．预电泳结束后，关闭电泳仪，用1×TBE缓冲液冲洗点样孔数遍，将上样孔中析出的尿素冲干净后，在每个点样孔中加入5μl样品；4．点样结束后，将电泳仪打开，在恒定80V电压下进行预电泳10min后，将电压调至140V，电泳1.5-2h，待下面一条指示带移动至胶板底部，停止电泳，取出凝胶，准备银染显色。3.2.9银染显色1．固定：待电泳结束后，取出玻璃板后，将两块玻璃板分开，将凝胶放入ddH2O中，快速漂洗2次，不超过5sec；后将固定液倒入，在摇床上震荡，固定20-30min后，ddH2O漂洗两次，每次不超过5sec；2．染色：将事先配制好染色液倒入，避光进行染色，在摇床上震荡20-30min，ddH2O漂洗两次，每次不超过5sec；3．显色：将事先配制好并预冷数分钟的显色液倒入，在摇床上震荡至满意为止；ddH2O漂洗两次，拍照，进行数据统计。40 各溶液具体配置方法（表19）：表19银染显色溶液配制体系Table19Systemofsolutionusedinsilverstaininganddeveloping溶液体系SolutionSystem固定液10%冰乙酸（50ml冰醋酸加ddH2O定溶至500ml）染色液0.1%硝酸银（0.5g硝酸银溶于500mlddH2O加37%甲醛溶液3ml）显色液10g氢氧化钠溶于500mlddH2O加37%甲醛溶液2ml3.2.10条带统计与分析已知HpaⅡ和MspⅠ是一组同裂酶，两种酶均识别5'-CCGG-3'序列甲基化状态，但是二者对于甲基化的敏感程度有所不同；MspⅠ对内部胞嘧啶甲基化敏感，对外部胞嘧啶甲基化不敏感，只能切割外部胞嘧啶没有发生甲基化的5'-CCGG-3'序列，所以当外部胞嘧啶发生甲基化时，MspⅠ将不能切割此甲基化位点；而HpaⅡ对半甲基化(即单链甲基化)较为敏感，对全甲基化(即双链甲基化)不敏感，只切割半甲基化的5'-CCGG-3'序列。因此，在EcoRⅠ/HpaⅡ酶切扩增产物中有带，而在EcoRⅠ/MspⅠ酶切扩增产物中没有出现带，则说明该位点发生了单链外侧的胞嘧啶甲基化，即半甲基化；如果EcoRⅠ/HpaⅡ酶切扩增产物中无带，而在MspⅠ酶切扩增产物中有带，则说明该位点发生了双链位点的内侧胞嘧啶甲基化，即全甲基化，从而有效区分基因组DNA甲基化状态。并对聚丙烯酰胺凝胶电泳后，对在各（H/M）泳道分别显示的带型进行分析,能够了解基因组DNA中5'-CCGG-3'位点甲基化的状态及模式。我们可根据根据泳道内条带的有无,可将条带类型分为3种:Ⅰ型，H、M酶切均有的条带，Ⅱ型，EcoRⅠ/HpaⅡ酶切有带，EcoRⅠ/MspⅠ酶切无带，单链外甲基化；Ⅲ型，EcoRⅠ/MspⅠ酶切无带，EcoRⅠ/HpaⅡ酶切有带，为双链内甲基化；在Excel内将有条带处记为“1”，无条带记为“0”，将得到的条带进行统计分析。41 4．结果与分析4.1玛瑙红樱桃无菌系的建立4.1.1外植体及灭菌方式对污染率及萌发率的影响结果表明，不同外植体、灭菌方式、灭菌时间都会对污染率、褐化率及萌发率有影响。其中，灭菌方式及时间对外植体的成活率及褐化率有较大的影响，进而使得萌发率降低；在选择出各种外植体的最佳灭菌时间后，外植体的不同对萌芽率有很大的影响，污染率、萌芽率也会有不同程度的影响，因此灭菌方式及外植体的选择对无菌系建立至关重要；采用休眠芽作为外植体存活率较高且污染率较小，无菌条件下接种的玛瑙红樱桃休眠芽在10d后逐渐萌发（图1A），25d后转入新的培养基中。结果表明，灭菌方式对春季侧芽的灭菌效果有很大影响（表20），0.1%升汞加入2滴Tween-80灭菌10min的处理方式，萌芽率最高能达到14%，实验证明75%的酒精对植物的成活率影响及较为明显，在实验中，酒精虽然会是污染率降低，但是会增加外植体的成活率，使其萌芽率降低（图1B）。表20不同灭菌方式对接种成活率的影响Table20Theinfluenceofdifferentmethodsonsurvivalrateofinvitroculture处理号接种数污染率（%）褐化率（%）萌发率（%）15072.028.0025068.030.0235056.040.0445040.054.0655036.062.0265080.018.0275072.022.0685068.018.01495066.022.012105060.030.01042 冬季休眠芽经过不同灭菌方式处理对其成活率的影响（表21）。结果表明，外植体为冬季休眠芽时，萌芽率最高能达到22%，由春芽及休眠芽的无菌系建立均可得出，75%的酒精对植物的成活率影响及较为明显，在实验中，酒精虽然会是污染率降低，但是会增加外植体的成活率，使其萌芽率降低。表21不同灭菌方式对接种成活率的影响Table21Theinfluenceofdifferentmethodsonsurvivalrateofinvitroculture处理号接种数污染率（%）褐化率（%）萌发率（%）15070.030.0025068.026.0635052.038.01045036.050.01455030.060.01065076.022.0275072.020.0885062.024.01495048.030.022105040.048.0124.1.2不同激素对组培苗增殖的影响激素对组培苗的增殖有重大影响。正交试验表明，4号处理中组培苗长势较其他处理旺盛，植株较高，叶色较深，增殖效果最好（图1C），确定玛瑙红樱桃最佳增殖培养基为：MS+1.0mg/LKT+0.1mg/L6-BA+0.5mg/LIBA+1.5mg/LGA3+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH（6.0-6.2）。根据DPS软件的得到的平均值及标准差可以得到以下结果（表22）：表明4号处理具有最显著水平，可以视作最有培养基配方。43 表22不同激素组合继代培养基的增殖效果Table22Themultiplyingeffectofdifferentsubculturemedia因子代号组合号Codeoffacters增殖系数CombinationMultiplyingcoefficientABCDnumber10.50.10.10.53.6±0.8d20.50.50.51.04.6±0.6cd30.51.01.01.54.4±0.5cd41.00.10.51.511.5±0.6a51.00.51.00.57.0±0.861.01.00.11.05.3±0.9c71.50.11.01.02.5±0.6e81.50.50.11.54.0±0.4d91.51.00.50.56.4±0.5b注：同列内相同字母表示经邓肯氏多重极差检验在0.05水平上差异不显著不同增殖处理对组培苗的增殖效果各不相同，其显著性如下图表示（图2），图2.不同激素组合继代培养基的增殖效果Fig.2TheeffectionofPGRconcentrationonshootmultiplycation注：相同字母表示经邓肯氏多重极差检验在0.05水平上差异不显著（下同）Note：Valuesfollowedbythedifferentnormallettersindicatesignificantdifferencesamongmaterialsat5%levels.44 4.1.3不同激素对组培苗壮苗及生根的影响玛瑙红樱桃组培苗在不同的激素种类及不同浓度的培养集中培养，其生根率、根长、根数及长势均有所不同。通过试验结果表明，实验表明，在4、7、13号处理中，植株在培养基为：4号处理：MS+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，7号处理：MS+0.3mg/LIBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，13号处理：MS+0.2mg/LIAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH（6.0-6.2）生根率达到75%，长势良好，主根粗壮且须根较多（图2D），且GA对玛瑙红樱桃的生根没有显著的影响。根据DPS软件的得到的根长及根数的平均值及标准差可以得到以下结果（表23）：表明4、7、13号处理具有较显著水平，且生根率最好，植株长势最好，可以视作最适生根壮苗培养基。表23不同处理对试管苗生根壮苗的影响Table23TheinfluenceofdifferentPGRonrootinductionofinvitroshoots处理生根率根数根长植株及根系形态（%）（cm）141.672.3±1.0g3.0±0.0c植株正常；根粗，呈黄褐色20.001.0±0.0ij0.0±0.0l植株矮小316.671.0±0.0ij1.5±0.6fgh植株矮小；根细呈乳白色475.007.8±1.0d2.8±0.5cd植株较壮；跟粗且须根多，呈乳白色58.331.0±0.0ij0.6±0.3jk植株正常；根细且少，呈乳白色68.331.0±0.0ij0.5±0.0kl植株呈病状；根细且少，呈乳白色775.009.8±1.0c2.4±0.5de植株较壮；主根粗壮，须根较多，呈黄褐色88.331.0±0.0ij0.5±0.0kl植株矮小；根细且少，呈乳白色941.673.0±0.8g1.5±0.4fgh植株较壮；根系正常，称黄褐色1033.334.0±0.8f2.8±0.5cd植株正常；根系正常，称黄褐色1125.001.8±0.5hi1.1±0.3ij植株正常；主根粗壮，呈黄褐色120.000.0±0.0jk0.0±0.0l植株矮小1375.0015.8±1.0a3.6±0.3ab植株较壮；主根粗壮，须根较多，呈黄褐色1425.001.3±0.5i1.5±0.6fgh植株呈病状；根细且少，呈乳白色158.331.0±0.0ij1.0±0.0ijk植株正常；根细且少，呈乳白色45 1658.335.5±1.3e1.7±0.3fg植株较壮；主根粗壮，须根较多，呈黄褐色1733.331.8±0.5hi2.0±0.8ef植株呈病状；根细且少，呈乳白色1850.002.8±0.5g3.8±0.5a植株正常；须根较多，呈黄褐色1975.0011.8±1.0b3.0±0.8c植株较壮；主根粗壮，须根较少，呈黄褐色2016.671.0±0.0ij1.0±0.0ijk植株正常；须根较多，呈黄褐色218.331.0±0.0ij1.0±0.0ijk植株正常；根粗，须根较少，呈黄褐色2258.334.0±0.8f1.4±0.3ij植株呈病状；根粗，呈黄褐色2325.002.3±0.5gh1.1±0.3ij植株呈病状；须根较多，呈黄褐色240.000.0±0.0jk0.0±0.0l植株矮小2575.0012.0±0.8b3.2±0.2bc植株呈病状；根粗，呈黄褐色268.331.0±0.01.0±0.0ijk植株正常；呈乳白色278.331.0±0.01.0±0.0ijk植株正常；呈乳白色注：同列内相同字母表示经邓肯氏多重极差检验在0.05水平上差异不显著4.1.4炼苗及移栽打开培养瓶后，在原有的培养条件下炼苗2-3d，连秒结束后取出组培苗，洗净根部培养基，移栽至已灭菌的基质中，置于温室中培养，每5-6d浇一次水，30d后部分植株能够呈现较好长势（图2E）。4.2体细胞无性系变异的ISSR检测4.2.1DNA提取采用新型植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取组培苗（每代组培苗随机选择三株，共24株）叶片DNA（图3），并用0.1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，RNA去除干净，无降解现象或降解很少，无污染，无拖尾，无弥散，且质量比较稳定，一致性较高，放入-20℃保存备用。46 图3.玛瑙红樱桃部分样品的DNA电泳图谱(DNA试剂盒提取)Fig.3TheelectrophoretogramofgeneticDNAofP.pseudocerasu‘Manaohong’invitroshoot4.2.2PCR扩增将上述84个ISSR引物及其退火温度的筛选后，最终确认下列21条ISSR引物（表24）的效果较好，条带清晰，可以对玛瑙红樱桃不同继代次数的组培苗叶片基因组DNA进行PCR扩增，表24用于ISSR扩增的21个引物及序列Table24ThearbitraryprimersandtheirsequenceusedforISSRanalysis引物序列引物序列PrimersSequencePrimersSequenceM01CACACACACACAR836AGAGAGAGAGAGAGAGYAM03CACCACACACARg840GAGAGAGAGAGAGAGAYTM05gCTgCTgCTgCTY846CACACACACACACACARTM08AgCAgCAgCAgCAY862AGCAGCAGCAGCAGCAGC807AGAGAGAGAGAGAGAGT863AGTAGTAGTAGTAGTAGT808AGAGAGAGAGAGAGAGC864ATGATGATGATGATGATG811GAGAGAGAGAGAGAGAC866CTCCTCCTCCTCCTCCTC812GAGAGAGAGAGAGAGAA868GAAGAAGAAGAAGAAGAA815CTCTCTCTCTCTCTCTG873GACAGACAGACAGACA816CACACACACACACACAT876GATAGATAGACAGACA47 4.2.3统计结果21条引物共扩增出95条清晰的谱带，引物扩增出的谱带数为3-6条，平均每个扩增4.5条。DAN长度均在250－2000bp之间，其中95条带全部为单态带，多态位点百分率为0(图4)，证明在经过8次继代后，玛瑙红樱桃组培苗的遗传性状保持一致。图4.不同继代次数玛瑙红樱桃组培苗代间遗传变异ISSR-PCR部分检测（引物846）（M为分子量标记，1-8泳道为随机取出的第1代至第8代组培苗材料，其中，a、b、c分别为每代组培苗的重复）Fig.4TheISSR–PCR（Primer846）ofdifferentcyclesofinvitroP.pseudocerasu‘Manaohong’shoots（MstandsforDNAmarker.）4.3离体材料的MSAP检测4.3.1基因组DNA的酶切与连接在进行DNA甲基化检测的过程中，第一步玛瑙红基因组DNA双酶切反应时DNA甲基化检测的关键步骤，是MSAP检测基础，必须在得到较好质量的基因组DNA的同时，保证其酶切完全，才能够继续试验；在MSAP检测技术中，对基因组DNA质量要求较为严格，DNA的纯度及浓度对实验有着至关重要的影响。在提取DNA后，要检测基因组DNA的纯度及浓度，方便双酶切体系中对DNA模板的浓度要求，双酶切要求体系中DNA模板浓度在体系中含量为400-800ng较为适合；由实验得出，双酶切必须充分，可以在37℃条件下酶切8-10h，酶切较为充分。48 4.3.2选择性扩增将预扩增产物稀释50倍时，选择性扩增的效果较为理想；选择性扩增从81对选择性扩增引物中筛选出17对引物（表25），对组培材料具有较好的多态性表达。表25MSAP分析的引物序列Table25SequenceofprimersusedforMSAPanalysis引物A序列引物B序列selectiveprimersSequenceselectiveprimersSequenceE+A+P2GTAGACTGCGTACCAATTCACAH/M+T+P1GAGTCCTGAGCGGTCAE+A+P4GTAGACTGCGTACCAATTCACCH/M+T+P2GAGTCCTGAGCGGTCCE+A+P5GTAGACTGCGTACCAATTCACGH/M+T+P3GAGTCCTGAGCGGTCTE+A+P7GTAGACTGCGTACCAATTCAACH/M+T+P4GAGTCCTGAGCGGTACE+A+P9GTAGACTGCGTACCAATTCAATH/M+T+P6GAGTCCTGAGCGGTGAH/M+T+P7GAGTCCTGAGCGGTAGH/M+T+P8GAGTCCTGAGCGGTTAH/M+T+P9GAGTCCTGAGCGGTGT4.3.3PAGE凝胶制备在进行PAGE凝胶制备时，加入各个药品后要及时混匀，以免出现局部凝胶，由于APS引发聚合，故在凝胶配置过程中，APS可以在配置凝胶时最后加入，防止凝胶在试验温度较高时发生局部聚合；且制胶过程中容易出现凝胶不聚合的状况，APS作为试验的引发剂，为凝胶溶液提供自由基，使丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺聚合；TEMED作为试验中的促凝剂，在它的作用下利用APS在溶液中提供的自由基，加速丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺聚合；4.3.4银染显色在进行银染显色时，第一步加入10%冰醋酸进行固定，轻摇至指示剂二甲苯氰颜色退去后即可进行染色。但在实验中发现，此实验步骤可以省略，在电泳结束后，取出凝49 胶用ddH2O清洗2次后，即可直接对凝胶进行染色；染色步骤中，0.1%硝酸银溶液中加入37%甲醛与否对染色的效果也不会有影响；因此，银染与显色的步骤中可以直接省略固定的步骤，在染色的步骤中0.1%硝酸银溶液中也不必加入37%的甲醛溶液。4.3.5统计结果将17对选择性扩增引物对8代离体组培苗基因组DNA进行选择性扩增结果进行统计分析，在Excel内将有条带处记为“1”，无条带记为“0”，将得到的条带进行统计分析（图5）。图5不同继代次数组培苗DNA甲基化部分电泳图（Mr为分子量标记）Fig.5ThedetectionofMSAPforDNAmethylationpolymorphismsinvitroofP.pseudocerasu‘Manaohong’shoots（MrstandsforDNAmarker.）从第1代至第8代，共扩增出5990条带，其中，全甲基化位点717个，半甲基化位点395个；得到各代组培苗DNA基因组半甲基化率、全甲基化率及总甲基化率（表26），可以看出，随着继代次数的增加，甲基化水平逐步增高；第8代组培苗的DNA甲基化情况，半甲基化率为8.0%，全甲基化率为12.5%，总甲基化率为20.5%，半甲基化率、全50 甲基化率及总甲基化率都是随着几代次数的增加，其甲基化水平也呈现逐步增加的趋势。表26不同继代次数玛瑙红樱桃组培苗DNA甲基化多态性Fig.26DNAmethylationpolymorphismsofdifferenecyclesofP.pseudocerasu‘Manaohong’invitroshoots条带类型总扩增条带数半甲基化率全甲基化率总甲基化率继代次数ⅠⅡⅢⅠ+Ⅱ+Ⅲ（%）（%）（%）165827717563.69.413.0263226817393.511.014.53614291007433.913.517.4458561877338.311.920.2557866917359.012.421.4658768917469.112.221.3760856997637.313.020.3861662977758.012.520.55．讨论5.1玛瑙红樱桃的无菌系体系的建立玛瑙红樱桃作为贵州特有的樱桃品种，其适应性良好，产量较高，具有较好的经济效益，为了能够快速获得大量品质优良的组培苗，离体培养成为必要手段；离体培养不仅能够快速繁殖，在植物品种改良、基因工程育种方面均发挥着重要作用，采用组织培养可为微嫁接（成密红等，2007）及茎尖脱毒（刘聪利等，2014）提供基础材料。本研究对玛瑙红樱桃增殖培养基内激素组合KT、6-BA、IBA、GA3进行筛选，结果证明4号组合培养基MS+1.0mg/LKT+0.1mg/L6-BA+0.5mg/LIBA+1.5mg/LGA3+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，达到了较高的增殖系数，平均增殖系数为11.5，组培苗长势良好，叶片生长正常，没有出现玻璃化，苗较高；其他樱桃离体培养的研究中，中国樱桃增殖培养基中对6-BA、NAA进行研究，增殖系数达到8.0（郑巧娜等，2011），贵州野生樱桃增殖培养基中对IBA、IAA进行研究，增殖系数4.42（陈红等，2014）；在甜樱桃组培苗生根研究中，魏明杰等（2012）研究了F14培养基及IBA对组培苗生根的作用；本研究对51 IAA、IBA、NAA以及与GA3组合对玛瑙红樱桃组培苗生根的影响，结果表明IBA、IAA对樱桃生根影响较为明显。5.2组培苗的体细胞无性系变异结合增殖及生根壮苗条件快速获得大量玛瑙红樱桃组培苗的同时，在离体培养过程中，体细胞无性系变异成为不可忽视的问题，植株发生体细胞遗传变异及表观遗传变异会导致优良性状的丢失，严重影响其利用价值（李卫国等，2008）。在组织培养的过程中，体细胞无性系变异为常见现象，变异率可以高达30%-40%（丰先红等，2010），因此对组培苗进行遗传变异鉴定尤为重要。在近年研究中，对樱桃组织培养的离体遗传变异及表观遗传变异均未见报道，仅利用生理生化方法对甜樱桃实生后代的部分品质性状的遗传变异进行了研究（郭梁等，2009）。本文利用ISSR检测方法对离体培养的玛瑙红樱桃樱桃组培苗进行遗传变异检测，在樱桃研究中，多利用ISSR技术进行种质资源的检测（陈新等，2014；宋常美等，2011），并未将ISSR检测技术利用与遗传变异检测，但在其他植物中，均有利用ISSR技术对离体材料进行遗传变异检测（于海玲等，2014；FANetal，2013）。本文采用ISSR标记，对建立的玛瑙红樱桃快繁体系培育的组培苗进行遗传变异检测，其可覆盖整个基因组DNA的多态性信息，并直接从DNA水平检测碱基序列的变化，本文结果得出DNA片段无论是带型还是谱带的强弱、数目均与再生前的母株DNA一致，这说明再生苗在DNA水平上并未发生变异，其遗传物质是稳定的，保持了母株的遗传特性。5.3玛瑙红樱桃组培苗甲基化变化DNA甲基化是表观遗传变异的主要形式，且DNA甲基化与植物的体细胞变异密切相关，在植物体内，甲基化/脱甲基化是一个高频发生的动态过程维持基因稳定性及基因表达调控是植物DNA甲基化的生物学作用（李娜等，2012）。离体培养时间及继代次数对植物的DNA甲基化水平有一定的影响（李浚明和朱登明，2005；Valledoretal，2007；Peredoetal，2009；陈兆贵和黄学林，2011），因此，对离体培养材料的DNA甲基化进行检测，有助对离体培养材料的种质资源遗传稳定性进行评估，为离体材料的繁殖及保存提供依据。本实验采用MSAP技术对DNA甲基化水平进行检测，目前该技术已在豌52 豆(Smykaletal，2007)、竹子(Gillisetal，2007)等许多植物离体培养材料种质鉴定中成功应用。Guo等(2007)在对党参愈伤组织再生植株的MSAP分析中表明，MSAP技术可检测出很高的多态性，其揭示出的表观遗传变异水平与RAPD、ISSR分析的遗传变异具有很高的一致性，表明离体材料的DNA甲基化与其遗传变异之间存在内在的联系。Joyce等（2002）应用MSAP技术研究4种离体方法培养马铃薯材料DNA甲基化的结果表明不同离体培养材料DNA甲基化模式存在很大差异，并对4种离体方法进行了评估，表明MSAP技术能够对离体材料培养和保存的遗传稳定性进行准确鉴定。玛瑙红樱桃的DNA甲基化检测表明，其甲基化水平随着继代次数逐步增高，第1至8代组培苗，第5代组培苗总甲基化率最高为21.4%，第8代组培苗总甲基化率下降，证明植物的甲基化与脱甲基化是一个动态变化的过程。6．结论1.建立玛瑙红樱桃的无菌体系，研究表明，在建立无菌系过程中，在同样的灭菌条件下，选择冬季休眠芽作为外植体的存活率较高，休眠芽在采用0.1%升汞滴加2滴Tween-80，灭菌10min的灭菌方法最好，成活率为22%；在灭菌过程中，75%的酒精对外植体的成活率有较大的影响，虽其能使外植体的污染绿减低，但外植体的褐化率随之增高，直接影响其存活率，故在建立无菌体系时，直接用0.1%升汞对外植体进行灭菌。2.研究过程中获得玛瑙红的最适增殖培养基配方为：MS+1.0mg/LKT+0.1mg/L6-BA+0.5mg/LIBA+1.5mg/LGA3+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH（6.0-6.2），增殖系数为11.5；获得玛瑙红的3个较为适合的生根培养基配方为：MS+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，MS+0.3mg/LIBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，MS+0.2mg/LIAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH（6.0-6.2）生根率均能达到75%，长势良好，主根粗壮且须根较多，并且有试验结果知道GA对玛瑙红樱桃的生根并没有显著的影。3.本研究对玛瑙红离体培养的第1代至第8代组培材料进行体细胞无性系遗传变异的ISSR检测，21条因无扩增结果表明，共扩增出95条带，条带清晰，引物扩增出的谱带数为3-6条，平均每个扩增4.5条。依片段大小，DAN长度均在250－2000bp之间，其中95条带全部为单态带，多态位点百分率为0在第1代至第8代组培苗的检测中，组织培养过程中的组培苗叶片与母株叶片相比较，没有发现特异性条带，表明遗传稳定性良好，未出现遗传变异。53 4.从对第1代至第8代组培苗的遗传变异检测结果显示，17对选择性扩增引物，共扩增出5990条带，其中，全甲基化位点717个，半甲基化位点395个；结果表明随着继代次数的增加，甲基化水平逐步增高；第1代至第5代呈逐步上升趋势，第5代组培苗的总甲基化率在研究及引物范围内最高，达到21.4%；第5代至第8代呈逐步下降趋势，第8代总甲基化率为20.5%；此结果为快速获取低变异率组培苗奠定了理论基础，并且为进一步的DNA甲基化研究提供了参考依据。本研究在无菌系体系建立方面仅对枝条侧芽作为外植体，研究其萌芽、增殖、生根及移栽；在遗传变异方面仅仅只对第1代至第8代的组培苗进行了遗传变异的ISSR检测及表观遗传变异的MSAP检测，本研究仅只对组织培养过程中，培养时间对体细胞无性系遗传变异的影响，研究内容还可以进一步扩增，将培养过程中的环境因素对遗传变异的影响进行进一步检测研究，例如，各个培养环节中，激素对遗传变异的影响。本研究仅采用两种方法对遗传变异进行初步检测，MSAP检测仅可对DNA基因组进行检测，没有办法对基因的特异性位点做精确的检测，本研究的下一步研究可以使用其他方法将基因组DNA甲基化更为精确地进行进一步检测，也可进行特定基因位点的检测，可以更深层挖掘相关基因的甲基化作用机理。54 致谢首先，要忠心的感谢我的导师文晓鹏教授在研究生三年期间对于我的学习及生活的教导及帮助。本论文在导师文晓鹏教授的悉心指导下完成选题、开题、中期，导师最开始从论文的选题、研究方向的把握、试验方案的确定及试验研究进展，再到论文的撰写及修改，导师都给予了极大的帮助，倾注了大量的心血和宝贵的时间。文老师严谨的治学态度、求真的科研态度、谦逊正直的品格永远都是我们只得学习的典范，时刻提醒我们应该用更远的目光去观察科研的发展及融合接纳新知识来充实自身的专业水平及科研水平，不能局限于自身的研究内容。再次衷心感谢问老师多年来的指导和教诲！感谢赵德刚教授、丁贵杰教授、喻理飞教授、赵杨教授、韦小丽教授、王德炉教授、谢双喜教授、周云超教授、聂琼教授、王志泰副教授、乔光老师、宋常美老师、何劲老师、王清老师、范付华老师、洪怡老师、杨凤老师、冯怡老师等老师，以及崔博文、张婷、刘厚宇、吴亚维、李望望、高国丽、刘鹏飞、陈楠、罗霞、包九零、葛菲、刘沛宇、杨鵾等试验室全体同仁在学习和生活中给予的帮助！感谢贵州生物工程研究院提供的一流的仪器设备、良好的学术氛围以及优秀的管理教育水平，是我们能够顺利完成试验及论文，也使得我们对专业的认识及科研水平都有了更大的提高。感谢我的父母、家人及朋友，给我的支持和帮助，陪伴我一起渡过三年的研究生生活，帮助我克服学习及生活中的困难！最后，向参加论文评阅及答辩的专家、教授及各位老师以最诚挚的谢意！55 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