结核分枝杆菌海藻糖磷酸磷酸酶诱导小鼠体液和细胞免疫应答

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1、结核分枝杆菌海藻糖磷酸磷酸酶诱导小鼠体液和细胞免疫应答张旻徐颖郄亚卿王九玲祝秉东王庆忠王洪海结核分枝杆菌（M.tuberculosis）是已经发现的最为重要的传染性病原体之一，每年可以引起8百万人感染结核病，导致2.5－3百万人死亡。目前最常用的结核疫苗是一株减毒的牛型结核杆菌，称为卡介苗（BCG）。BCG的对于不同人群的保护效率差异非常大，从0％到85%。因此控制这种全球性疾病急需发展新的抗结核疫苗。I型辅助性T细胞介导的免疫反应是机体防御分枝杆菌病原体的必要手段。具有显著T细胞免疫和B细胞免疫的结核

2、新抗原的发现有助于发展新的结核疫苗。结核分枝杆菌基因组中有两个可能编码海藻糖磷酸磷酸酶的开放阅读框：otsB1(Rv2006)和otsB2(Rv3772)。Edavana等证明OtsB2蛋白具有海藻糖磷酸磷酸酶的功能，而OtsB1蛋白没有磷酸酶的活性。结核分枝杆菌otsB1基因的缺失突变型相对于野生型生长没有明显差异，而otsB2基因对于结核分枝杆菌的生长是必需的。为进一步阐述海藻糖磷酸磷酸酶（trehalose-6-phosphatephosphatase,TPP，由otsB2基因编码）的生物学功能，

3、我们对TPP做了亚细胞定位，发现TPP存在于结核分枝杆菌和BCG的细胞壁和细胞膜上。分别用TPP蛋白和BCG免疫小鼠，检测了TPP诱导的小鼠体液和细胞免疫反应。材料和方法1.实验菌种和培养条件大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)分别用于克隆和表达TPP。大肠杆菌在含有25μg/ml的卡那霉素的LB培养基中培养。结核分枝杆菌和BCG用改良苏通培养基或含有10％(v/v)oleicacid-albumin-dextrosecomplex的Middlebrook7H10琼脂培养。2．TPP的表达纯化以及兔抗T

4、PP血清的制备从结核分枝杆菌H37Rv基因组中克隆TPP编码基因otsB2，然后在E.coli.BL21(DE3)中表达，通过Ni-NTA亲合层析纯化TPP蛋白。0.2mg纯化的TPP蛋白与弗氏不完全佐剂混合皮下多点免疫3个月的新西兰白兔，然后加强免疫4次，制备抗血清。3．分枝杆菌的亚细胞分离收集对数生长早期的结核分枝杆菌H37Rv和BCG。培养上清通过0.22um的虑膜过滤，冷冻干燥浓缩后，在PBS中透析，获得培养上清滤过性蛋白。分枝杆菌菌体用PBS清洗2次后，悬浮于含有蛋白酶抑制剂的PBS中，超声破

5、碎。裂解液11000g离心5min，去除没有破碎的菌体。裂解液上清27000g离心1h，得到的沉淀为细胞壁组份。上清100000g继续离心4h分离细胞膜（沉淀）和细胞质（上清）。用PBS分别清洗细胞壁和细胞膜组份3次。细胞质组份继续在100000g离心4h，以保证所有的细胞膜组份分离出细胞质组份。所分离的各细胞组份用每种组份的抗体识别分子标签鉴定，例如细胞质65kDa蛋白、细胞膜38kDa蛋白、细胞壁分泌性蛋白Ag85的特异性抗体。4.Western杂交所有的细胞组份悬浮于PBS中，SDS-PAGE(1

6、0%，w/v丙稀酰胺)每个泳道上样量为相当于500μl培养液分离所得到的蛋白。电泳后将蛋白电转到PVDF膜上，用制备的兔抗TPP血清做一抗，羊抗兔IgG抗体做二抗检测。5．实验动物及动物免疫C57BL/6小鼠（25g，雌性），购于上海第二军医大学；随机分为4组。收集的BCG菌体悬浮于PBS中，终浓度约为200mg/ml。BCG免疫组（4只）的每只小鼠皮下注射100μl（涂板计数为5×106CFU）的BCG悬浮液，PBS对照组的每只小鼠皮下注射100μl的PBS。TPP蛋白免疫组（4只）的小鼠每周皮下注射

7、与弗氏不完全佐剂（IFA）混匀的50μg的TPP蛋白，总共免疫3次。IFA对照组小鼠用IFA免疫。6．ELISA测定IgG1和IgG2a收集BCG和PBS免疫组小鼠免疫3周后的血清，以及蛋白TPP和IFA免疫组小鼠最后一次免疫1周后的血清。ELISA检测血清中TPP特异性IgG1和IgG2a抗体滴度。并与分枝杆菌抗原85B（Ag85B）做比较。酶标板（Nunc）用5μg/ml的纯化蛋白（TPP或Ag85B）100μl/孔包被，4°C过夜；用含有1%BSA的PBST封闭2h；待测血清用含有1%BSA的PB

8、ST稀释1250倍，然后再等倍稀释。加入待测血清100μl，37°C孵育1h；HRP标记的羊抗鼠IgG1或IgG2a作为二抗，每孔100μl，37°C孵育1h；每孔加100μlOPD显色液，37°C闭光反应20min，每孔加50μl7%H2SO4终止反应，于492nm波长处读取吸光度值。7．ELISPOT检测IFN-γ无菌取出小鼠脾脏，研碎后经尼龙网过滤得到单细胞；用淋巴细胞分离液（CedarlanLab）分离小鼠淋巴细胞。然后用IFN-γ